Rapid and simple gas chromatography-mass spectrometry method for quantification of methylmalonic acid in plasma and urine: its application to the diagnosis of methylmalonic acidurias

Methylmalonic aciduria is a group of organic aciduria associated with methylmalonyl-CoA mutase and cobalamin metabolic defects. Methylmalonic acidurias (MMAuria) are a heterogeneous group of inborn metabolic errors biochemically characterized by the accumulation of methylmalonate in urine and other body fluids. MMAuria exclusively affecting MCM activity (mut0,mut -,cblA and cblB) are termed isolated MMAuria. Some of these defects additionally affect the metabolism of methylcobalamin (MeCbl) resulting in combined MMA and homocysteinuria (cblC,cblD,cblF). Although the causes of Methylmalonic acidurias (MMAuria) are etiology, the clinical presentation of affected patients is similar. The majority of patients display early in life recurrent vomiting, dehydration, hepatomegaly, respiratory distress, muscular hypotonia and progressive alteration of consciousness, probably degenerating to overwhelming illness, deep coma and death. Severe combined keto-and lactic acidosis, hypo- or hyper-glycaemia, neutropenia, hyperglycinaemia and hyperammonaemia are the most important laboratory features. Without specific therapy these episodes result in severe handicap or death. We developed a rapid and sensible GC/MS method using stable isotope dilution to diagnose and quantify methylmalonic acid in urine and plasma. Stable isotope dilution is an ideal internal standard and is considered the gold standard method for measuring metabolites because it obviates the problem of varying levels of extraction efficiency by solvent extraction methods. Our methodology is capable of monitoring and quantifying MMA and it can follow up on and diagnose methylmalonic acidurias. The method requires a sequence of steps: extraction from urine and plasma using liquid–liquid extraction, drying, and finally derivatization by BSTFA of extraction products to form trimethylsilyl derivates prior to GC/MS injection. The method was validated. The validation follows a plan that includes the scope of the method, the method performance characteristics and its acceptance limits. Parameters examined in the validation process were limit of detection and quantification, reproducibility, linearity and recovery. For blood MMA with added analyte, the limit of detection or limit of the blank (mean plus 3 SD of blank) for was 0.1 µmol/l and the limit of quantification (mean plus 10 SD of blank) 0.8 µmol/l; For urine MMA with added analyte, the limit of detection or limit of the blank (mean plus 3 SD of blank) for was 0.1 µmol/l and the limit of quantification (mean plus 10 SD of blank) 0.7 µmol/l. For urine and plasma the linearity range was from 0.1 mol/l to 400 mol/l. Normal methylmalonic acid values were obtained from plasma and urine of 50 healthy control patients. The method was clinically validated by analyzed 10 samples from patients with three phenotypic variant of methylmalonic aciduria and therefore could be suitable for implementation in routine clinical screening programs and quantification environments.

L’aciduria metilmalonica rappresenta un gruppo di acidurie organiche che comprendono principalmente difetti metabolici della metilmalonil-CoA mutasi e difetti del metabolismo della cobalamina. Le acidurie metilmaloniche (MMAs) sono un gruppo eterogeneo di errori congeniti del metabolismo caratterizzate biochimicamente dall’accumulo di metilmalonato nelle urine e in altri fluidi corporei. Le MMAs che coinvolgono esclusivamente l’attività enzimatica della metilmalonil-CoA mutasi (mut0, mut - ,cblA and cblB) sono definite MMAs isolate. I difetti che influiscono sul metabolismo della metilcobalamina (MeCbl), cofattore di più cicli metabolici, presentano un contemporaneo accumulo di acido metilmalonicico ed omocistinuria (cblC,cblD,cblF). Sebbene l’eziologia delle acidurie metilmaloniche sia eterogena il quadro clinico dei pazienti é simile. Nella maggior parte dei pazienti la sintomatologia si presenta, in età neonatale, con vomito ricorrente, disidratazione, epatomegalia, sofferenza respiratoria, ipotonia muscolare e progressiva alterazione dello stato di coscienza con probabile evoluzione in malattia ingravescente, coma profondo e morte. Le alterazioni di laboratorio più importanti sono una severa cheto-lattico acidosi, un’ ipo o iperglicemia, una neutropenia, un’iperglicinemia ed un’iperammoniemia che, se non corrette con un pronto e specifico intervento terapeutico possono portare a gravi handicap o morte. Abbiamo sviluppato un metodo rapido e sensibile in cromatografia gassosa e spettrometria di massa utilizzando il metodo di diluizione isotopica per la quantificazione dell’acido metilmalonico nelle urine e nel plasma, utile per la diagnosi delle MMAs e nel follow up. La diluizione isotopica con isotopi stabili è considerato il metodo gold standard per la misurazione dei metaboliti perché essendo l’isotopo lo standard ideale, risolve il problema dell’ efficienza dell’estrazione nei metodi che si avvalgono dell’ estrazione con solvente. Il metodo richiede fasi successive: l'estrazione dalle urine e dal plasma con estrazione liquido-liquido, l'essiccazione dell’estratto e infine la derivatizzazione con BSTFA dei prodotti di estrazione per formare i trimetilsilil derivati prima di essere iniettati nel GC/MS. Il metodo è stato validato seguendo un piano che comprende il campo di applicazione del metodo, le caratteristiche di efficacia del metodo e dei suoi limiti di accettazione. I parametri esaminati nel processo di validazione sono stati: limite di rivelazione e quantificazione, accuratezza, precisione, linearità e il recupero del MMA. Per il MMA plasmatico con l’aggiunta dell’analita, il limite di rilevazione o il limite del bianco (media più 3 SD del bianco) è stato di 0,1 µmol/l ed il limite di quantificazione (media più 10 SD del bianco) 0.8 µmol/l; per il MMA urinario con l’aggiunta dell’analita, il limite di rilevazione o limite del bianco (media più 3 SD del bianco) è stato di 0,1 µmol/l ed il limite di quantificazione (media più 10 SD del bianco) 0,7 µmol/l. Il range di linearità per le urine ed il plasma è compreso tra 0,1-400 µmol/l. I valori normali di acido metilmalonico (plasma e urine) sono stati ottenuti da 50 pazienti sani di controllo. Il metodo è stato validato clinicamente analizzando 10 campioni prelevati da pazienti con tre varianti fenotipiche della aciduria metilmalonica. Il metodo oltre alla suo uso nella routine clinica potrebbe essere utilizzato come metodo nei programmi screening.