In this experimental work the mechanism of action of drugs, which have as intracellular target the Glutathion S-Transferases (GST), is investigated. GST are a family of enzymes involved in the detoxification pathway. These enzymes catalyze the conjugation of glutathione (GSH) to a wide variety of endogenous and exogenous electrophilic compounds, leading to a more soluble species which can be easily eliminated. Furthermore, GST are endogenous modulators of proteins involved in the apoptotic pathway. From the last century, it is known that the aberrant expression of GST isozymes is correlate with tumor onset and implicated in the development of resistance toward chemotherapy agents. We used two different approaches studying GST as target for the development of new anticancer compounds. We synthesized new molecules starting from the 6-(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-ylthio)exanol (NBDHEX), a promising inhibitor of Pi and Mu classes of GSTs (GSTP1-1 and GSTM2-2), with the aim to produce compounds more soluble and specific for the GSTP1-1 (section 1). Moreover, we characterize the mechanism of action of brostallicin, which take advantage from the overexpression of GSH/GST system to lead a molecules able to bind DNA (section 2). 1. The crystallographic analysis of the active site of GSTM2-2 and GSTP1-1 reveals that the residues in the H site of both isoenzymes well stabilize the benzossadiazole ring. However in the active site of GSTP1-1 the interactions can be improved. In particular, the interaction among the nitro group, which has a negative charge when forming Ï - complex, and some residues which have a positive charges, and also between alcoholic chain of NBDHEX with the active site. Based on these evidences we will assess the effects of the substitution of the nitro group with a sulfonic one and the changing of the alcoholic chain with aromatic group variously substituted. The resulting molecules are: 6-(7- sulfo-2,1,3-benzossadiazol-4-ylthio)exanol (SBDHEX), and derivatives of the nitrobenzofurazane ring, functionalized on the lateral chain: 2759, 2766, 2760, 2868, 2871, 2872, 2874, 2875 e 2876. These compounds are less effective than NBDHEX, however we collect important information to better design new inhibitor with bezoxadiazole bone. From our studies we clarified the important of the nitro group. Infact, the nitro group make possible the interaction with the enzyme because SBDHEX does not interact with GSTP1-1 and the molecule is not able to form the Ï -complex. The benzene ring improve the selectivity towards the GSTP1-1. Finally, compounds which are more soluble (SBDHEX, 2760, 2875) have less cytotoxic effect because of they are unable to diffuse cell membrane. 2. Brostallicin is a pro-drug which take advantage of the overexpression of GSH/GST system. Based on this evidence we clarify the mechanism of action of this compound which is in clinical trial. Through different experimental approaches we can conclude that both GSTP1-1 than GSTM2-2 catalyze the reaction between brostallicin and GSH. In particular, the affinity of brostallicin is higher for GSTM2-2 and the drug is fully active at the concentration using in cancer treatment. Both isoenzyme catalyze the formation of an intermediate reactive species, which is slowly converted into the final products. This intermediate, identified as the alpha-chloroamido derivative of the GSH-brostallicin adduct, is able to alkylate DNA in a sequence-specific manner and appears to be the active form of the drug. The kinetic behavior of the reaction between brostallicin and GSH, catalyzed by GSTP1-1, has been studied in detail, and a minimum kinetic scheme that suitably describes the experimental data is provided. Overall, these data fully support and extend the findings that brostallicin could be indicated for the treatment of tumor overexpressing the pi or mu class GST.

Nella presente tesi si è studiato il meccanismo d' azione di molecole che hanno come bersaglio intracellulare la Glutatione S-trasferasi (GST). Le GST sono una famiglia di enzimi di detossificazione. La reazione generale catalizzata da tutte le isoforme è la coniugazione del glutatione (GSH) ad una molecola contenente un gruppo elettrofilo. Tale reazione permette lâ eliminazione della molecola in quanto il coniugato è più solubile ed atto a essere escreto. Inoltre, le GST sono dei modulatori endogeni della proteine che regolano la morte cellulare programmata (apoptosi). Dal secolo scorso, è noto che l' iperespressione delle GST è associata all' insorgenza dei tumori e porta alla resistenza ai farmaci chemioterapici. Lo studio è stato condotto su due fronti. Sono stati sintetizzati e caratterizzati degli analoghi del 6-(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-yltio)esanolo (NBDHEX), un promettente inibitore di alcune classi di GST(GSTP1-1, GSTM2-2), con lo scopo di individuare delle molecole più idrosolubili e con una maggiore selettività verso l' isoforma GSTP1-1, iperespressa nei tumori (parte 1). Inoltre è stato caratterizzato il meccanismo d' azione della brostallicina, una molecola che sfrutta l' iperespressione del sistema GSH/GST per la produzione di una specie alchilante del DNA (parte 2). 1. L' analisi cristallografica del sito attivo della GSTM2-2 e della GSTP1-1 ha messo in evidenza che lâ anello benzossadiazolico è ben stabilizzato dai residui aminoacidici presenti nel sito H di entrambe le isoforme. Nel sito attivo della GSTP1-1, invece, si possono migliorare le interazioni tra il nitro gruppo, carico negativamente, e alcuni residui carichi positivamente. Inoltre la catena alcolica dell'NBDHEX interagisce solo debolmente con i residui aminoacidici della sito attivo. Basandosi su queste evidenze, si sono valutati gli effetti della sostituzione del gruppo nitro con un gruppo solfonico e la variazione della catena alcolica con un gruppo benzene variamente sostituito. I composti che ne sono derivati sono: il 6-(7-sulfo-2,1,3-benzossadiazol-4-yltio)esanolo (SBDHEX), e derivati del nitrobenzofurazano funzionalizzati in catena laterale, a cui sono state date le sigle 2759, 2766, 2760, 2868, 2871, 2872, 2874, 2875 e 2876. Questi composti, sebbene non si siano dimostrati più efficaci dellâ NBDHEX hanno fornito informazioni utili per la progettazione di nuovi inibitori con scheletro nitro-benzossafurazanico. Dagli studi condotti è emerso che il gruppo-nitro è fondamentale per l' interazione con l' enzima poiché l' SBDHEX non sembra interagire con la GSTP1-1 e non è in grado di formare un complesso-Ï . La presenza di un anello aromatico, come sostituente della catena laterale dell' anello benzossadiazolico, aumenta la selettività delle molecole nei confronti dell' isoforma GSTP1-1. Infine, le molecole estremamente solubili (SBDHEX, 2760, 2875) hanno un basso effetto citotossico imputabile alla loro difficoltà di diffondere nel doppio strato fosfolipidico. 2. La brostallicina un pro-farmaco che sfrutta l' iperespressione del sistema GSH/GST. Partendo dalle evidenze indirette, è stato chiarito e caratterizzato il meccanismo citotossico di questa molecola che è in fase di sperimentazione clinica. Dagli studi condotti con differenti tecniche sperimentali è stato possibile concludere che sia la GSTP1-1 che la GSTM2-2 catalizzano la reazione tra la brostallicina e il GSH. In particolare, l' isoforma GSTM2-2 ha un' affinità maggiore verso la molecola e ne permette l' impiego in quei tumori che la iperesprimono. Entrambe le isoforme catalizzano la formazione di un intermedio di reazione, l' addotto brostallicina-GSH, che presenta un cloro come sostituente del Cα. Questo intermedio è convertito lentamente nei prodotti di reazione in cui il cloro viene sostituito da un gruppo fosfato o un ossidrile. Basandosi sui dati cinetici, è stato proposto un meccanismo per spiegare in modo soddisfacente la reazione tra brostallicina e GSH catalizzata dalla GSTP1-1. Infine l' ipotesi che il composto con il cloro potesse rappresentare la forma attiva del farmaco, è stata validata utilizzando la tecnica dell' interruzione della polimerasi. Infatti questa molecola, in assenza di GSH/GST, è in grado di alchilare il DNA con la stessa specificità di sequenza della miscela contenete brostallicina, GSH e GSTP1-1. Questi studi hanno permesso di chiarire il ruolo svolto dalle GST nel meccanismo d' azione della brostallicina e il motivo per cui questo chemioterapico sia avvantaggiato dallâ iperespressione del sistema GSH/GST.

Pezzola, S. (2010). Glutatione s-trasferasi p1-1 come possibile bersaglio per lo sviluppo di nuovi chemioterapici: un approccio bivalente.

Glutatione s-trasferasi p1-1 come possibile bersaglio per lo sviluppo di nuovi chemioterapici: un approccio bivalente

PEZZOLA, SILVIA
2010-03-16

Abstract

Nella presente tesi si è studiato il meccanismo d' azione di molecole che hanno come bersaglio intracellulare la Glutatione S-trasferasi (GST). Le GST sono una famiglia di enzimi di detossificazione. La reazione generale catalizzata da tutte le isoforme è la coniugazione del glutatione (GSH) ad una molecola contenente un gruppo elettrofilo. Tale reazione permette lâ eliminazione della molecola in quanto il coniugato è più solubile ed atto a essere escreto. Inoltre, le GST sono dei modulatori endogeni della proteine che regolano la morte cellulare programmata (apoptosi). Dal secolo scorso, è noto che l' iperespressione delle GST è associata all' insorgenza dei tumori e porta alla resistenza ai farmaci chemioterapici. Lo studio è stato condotto su due fronti. Sono stati sintetizzati e caratterizzati degli analoghi del 6-(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-yltio)esanolo (NBDHEX), un promettente inibitore di alcune classi di GST(GSTP1-1, GSTM2-2), con lo scopo di individuare delle molecole più idrosolubili e con una maggiore selettività verso l' isoforma GSTP1-1, iperespressa nei tumori (parte 1). Inoltre è stato caratterizzato il meccanismo d' azione della brostallicina, una molecola che sfrutta l' iperespressione del sistema GSH/GST per la produzione di una specie alchilante del DNA (parte 2). 1. L' analisi cristallografica del sito attivo della GSTM2-2 e della GSTP1-1 ha messo in evidenza che lâ anello benzossadiazolico è ben stabilizzato dai residui aminoacidici presenti nel sito H di entrambe le isoforme. Nel sito attivo della GSTP1-1, invece, si possono migliorare le interazioni tra il nitro gruppo, carico negativamente, e alcuni residui carichi positivamente. Inoltre la catena alcolica dell'NBDHEX interagisce solo debolmente con i residui aminoacidici della sito attivo. Basandosi su queste evidenze, si sono valutati gli effetti della sostituzione del gruppo nitro con un gruppo solfonico e la variazione della catena alcolica con un gruppo benzene variamente sostituito. I composti che ne sono derivati sono: il 6-(7-sulfo-2,1,3-benzossadiazol-4-yltio)esanolo (SBDHEX), e derivati del nitrobenzofurazano funzionalizzati in catena laterale, a cui sono state date le sigle 2759, 2766, 2760, 2868, 2871, 2872, 2874, 2875 e 2876. Questi composti, sebbene non si siano dimostrati più efficaci dellâ NBDHEX hanno fornito informazioni utili per la progettazione di nuovi inibitori con scheletro nitro-benzossafurazanico. Dagli studi condotti è emerso che il gruppo-nitro è fondamentale per l' interazione con l' enzima poiché l' SBDHEX non sembra interagire con la GSTP1-1 e non è in grado di formare un complesso-Ï . La presenza di un anello aromatico, come sostituente della catena laterale dell' anello benzossadiazolico, aumenta la selettività delle molecole nei confronti dell' isoforma GSTP1-1. Infine, le molecole estremamente solubili (SBDHEX, 2760, 2875) hanno un basso effetto citotossico imputabile alla loro difficoltà di diffondere nel doppio strato fosfolipidico. 2. La brostallicina un pro-farmaco che sfrutta l' iperespressione del sistema GSH/GST. Partendo dalle evidenze indirette, è stato chiarito e caratterizzato il meccanismo citotossico di questa molecola che è in fase di sperimentazione clinica. Dagli studi condotti con differenti tecniche sperimentali è stato possibile concludere che sia la GSTP1-1 che la GSTM2-2 catalizzano la reazione tra la brostallicina e il GSH. In particolare, l' isoforma GSTM2-2 ha un' affinità maggiore verso la molecola e ne permette l' impiego in quei tumori che la iperesprimono. Entrambe le isoforme catalizzano la formazione di un intermedio di reazione, l' addotto brostallicina-GSH, che presenta un cloro come sostituente del Cα. Questo intermedio è convertito lentamente nei prodotti di reazione in cui il cloro viene sostituito da un gruppo fosfato o un ossidrile. Basandosi sui dati cinetici, è stato proposto un meccanismo per spiegare in modo soddisfacente la reazione tra brostallicina e GSH catalizzata dalla GSTP1-1. Infine l' ipotesi che il composto con il cloro potesse rappresentare la forma attiva del farmaco, è stata validata utilizzando la tecnica dell' interruzione della polimerasi. Infatti questa molecola, in assenza di GSH/GST, è in grado di alchilare il DNA con la stessa specificità di sequenza della miscela contenete brostallicina, GSH e GSTP1-1. Questi studi hanno permesso di chiarire il ruolo svolto dalle GST nel meccanismo d' azione della brostallicina e il motivo per cui questo chemioterapico sia avvantaggiato dallâ iperespressione del sistema GSH/GST.
A.A. 2009/2010
Biotecnologie mediche e medicina molecolare
22.
In this experimental work the mechanism of action of drugs, which have as intracellular target the Glutathion S-Transferases (GST), is investigated. GST are a family of enzymes involved in the detoxification pathway. These enzymes catalyze the conjugation of glutathione (GSH) to a wide variety of endogenous and exogenous electrophilic compounds, leading to a more soluble species which can be easily eliminated. Furthermore, GST are endogenous modulators of proteins involved in the apoptotic pathway. From the last century, it is known that the aberrant expression of GST isozymes is correlate with tumor onset and implicated in the development of resistance toward chemotherapy agents. We used two different approaches studying GST as target for the development of new anticancer compounds. We synthesized new molecules starting from the 6-(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-ylthio)exanol (NBDHEX), a promising inhibitor of Pi and Mu classes of GSTs (GSTP1-1 and GSTM2-2), with the aim to produce compounds more soluble and specific for the GSTP1-1 (section 1). Moreover, we characterize the mechanism of action of brostallicin, which take advantage from the overexpression of GSH/GST system to lead a molecules able to bind DNA (section 2). 1. The crystallographic analysis of the active site of GSTM2-2 and GSTP1-1 reveals that the residues in the H site of both isoenzymes well stabilize the benzossadiazole ring. However in the active site of GSTP1-1 the interactions can be improved. In particular, the interaction among the nitro group, which has a negative charge when forming Ï - complex, and some residues which have a positive charges, and also between alcoholic chain of NBDHEX with the active site. Based on these evidences we will assess the effects of the substitution of the nitro group with a sulfonic one and the changing of the alcoholic chain with aromatic group variously substituted. The resulting molecules are: 6-(7- sulfo-2,1,3-benzossadiazol-4-ylthio)exanol (SBDHEX), and derivatives of the nitrobenzofurazane ring, functionalized on the lateral chain: 2759, 2766, 2760, 2868, 2871, 2872, 2874, 2875 e 2876. These compounds are less effective than NBDHEX, however we collect important information to better design new inhibitor with bezoxadiazole bone. From our studies we clarified the important of the nitro group. Infact, the nitro group make possible the interaction with the enzyme because SBDHEX does not interact with GSTP1-1 and the molecule is not able to form the Ï -complex. The benzene ring improve the selectivity towards the GSTP1-1. Finally, compounds which are more soluble (SBDHEX, 2760, 2875) have less cytotoxic effect because of they are unable to diffuse cell membrane. 2. Brostallicin is a pro-drug which take advantage of the overexpression of GSH/GST system. Based on this evidence we clarify the mechanism of action of this compound which is in clinical trial. Through different experimental approaches we can conclude that both GSTP1-1 than GSTM2-2 catalyze the reaction between brostallicin and GSH. In particular, the affinity of brostallicin is higher for GSTM2-2 and the drug is fully active at the concentration using in cancer treatment. Both isoenzyme catalyze the formation of an intermediate reactive species, which is slowly converted into the final products. This intermediate, identified as the alpha-chloroamido derivative of the GSH-brostallicin adduct, is able to alkylate DNA in a sequence-specific manner and appears to be the active form of the drug. The kinetic behavior of the reaction between brostallicin and GSH, catalyzed by GSTP1-1, has been studied in detail, and a minimum kinetic scheme that suitably describes the experimental data is provided. Overall, these data fully support and extend the findings that brostallicin could be indicated for the treatment of tumor overexpressing the pi or mu class GST.
gluatione S-trasferasi; NBDHEX; chemioterapici; brostallicina; osteosarcoma; GSTP1-1; farmacoresistenza
Settore BIO/12
Italian
Tesi di dottorato
Pezzola, S. (2010). Glutatione s-trasferasi p1-1 come possibile bersaglio per lo sviluppo di nuovi chemioterapici: un approccio bivalente.
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