Silenziamento vs inibizione farmacologica della poli (adp-ribosio) polimerasi-1 (parp-1): differenti effetti sulla chemio-sensibilità tumorale, in vivo ed in vitro

Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)-1 and PARP-2 are nuclear proteins which share with the other members of the PARP family the ability to use NAD+ as a substrate to catalyse the synthesis and attachment of ADP-ribose polymers to acceptor proteins altering their activity. Most of the cellular poly(ADP-ribosyl)ating activity has been attributed to PARP-1 whose primary targets include PARP-1 itself, histones and a variety of transcription factors. Among the members of the PARP family, only PARP-1 and PARP-2 are activated by single and double strand breaks as an early response to DNA damage. The enzymes bind to DNA and co-ordinate the repair of genotoxic damage including that provoked by DNA methylating agents. Indeed, PARP inhibition has been shown to restore susceptibility to the methylating agent temozolomide (TMZ) in several preclinical models and PARP inhibitors are under evaluation in phase II clinical trials as enhancer of chemotherapy efficacy. PARP-1 also plays a key role in inflammation contributing to cellular energetic failure. In fact, the oxidant species generated during the inflammatory reaction cause DNA damage and PARP-1 hyper-activation. This leads to elevated NAD+ consumption for the synthesis of ADP-ribose polymers and consequent ATP depletion in an attempt to restore the cellular pool of NAD+. Moreover, PARP-1 enhances the activities of key transcription factors such as NF-kB which regulates the expression of inflammatory mediators, adhesion molecules and cytokines. It is recognized that inflammation contributes to the development and progression of a variety of cancer types. Tumour-infiltrating lymphocytes, macrophages and tumour cells are known to produce several inflammatory cytokines, which, in turn, can enhance the tumourigenic process by up-regulating mediators of angiogenesis such as vascular endothelial growth factor (VEGF). Recently, we have demonstrated that impairment of PARP-1 function hampers angiogenesis as indicated by the reduction of blood vessel neo-formation in response to angiogenic stimuli observed either in PARP-1 KO mice or in endothelial cells treated with PARP inhibitors. Aims Since PARP-1 may affect protein function also by a direct protein-protein interaction not mediated by the ADP-ribose polymers we have investigated the influence of the lack of PARP-1 expression on tumour aggressiveness and chemosensitivity. Moreover, the results obtained with PARP-1 silenced tumours were compared to those obtained by pharmacological inhibition of PARP activity. In fact, the so far available PARP inhibitors affect only the catalytic activity of PARPs and are not selective for PARP-1 but they inhibit also PARP-2 function. Specific aims of the present work were: 1) to assess the influence of abrogation of PARP-1 on tumour chemosensitivity to the wide spectrum methylating agent TMZ and to the N3-adenine selective methylating agent {1-methyl-4-[1-methyl-4-(3-methoxysulfonylpropanamido)pyrrole-2-carboxamido]pyrrole-2-carbox-amido}propane (Me-Lex), and to investigate whether susceptibility of PARP-1 silenced tumour cell lines to these compounds can be further affected by pharmacological inhibition of cellular PARP activity using PARP-1/-2 inhibitors; 2) to study in PARP-1 silenced tumours the cell cycle modifications and the modulation of proteins involved in cell cycle progression induced by treatments with methylating compounds, used as single agents or in combination with PARP inhibitors; 3) to investigate the role of PARP-1 silencing in melanoma aggressiveness and chemoresistance in vivo. Results Stable silencing of PARP-1 expression in melanoma or cervical carcinoma lines enhances the in vitro sensitivity to TMZ and Me-Lex, and induces a higher level of cell accumulation at the G2/M phase of cell cycle with respect to controls. GPI 15427, a potent inhibitor of both PARP-1 and PARP-2, is capable of increasing tumour sensitivity to TMZ and Me-Lex both in PARP-1-proficient and -deficient cells. Treatment of PARP-1 silenced cells with TMZ or Me-Lex results in more extensive phosphorylation of Chk-1 and p53 as compared to PARP-1 proficient cells. The combination of the methylating agents with GPI 15427 further increases Chk-1 and p53 phosphorylation both in PARP-1-proficient or -deficient cells. Whilst the growth characteristics of PARP-1-deficient melanoma cells are comparable to those of PARP-1-proficient cells in vitro, their tumourigenic potential in vivo results to be significantly compromised. In fact, mice challenged intra-muscle with PARP-1-deficient cells show a delayed development of measurable tumour nodules, which are also significantly reduced in size with respect to those of mice inoculated with PARP-1-proficient control cells. Moreover, animals challenged intra-cranially with PARP-1-deficient cells, a model that mimics CNS localisation of melanoma, show an increased survival. Noteworthy, immunohistochemical analysis of PARP-1-depleted melanoma grafts indicates a reduced expression of the angiogenic marker PECAM-1/CD31 and of the pro-inflammatory mediators TNF-alfa and GITR. In order to study the role of PARP-1 in melanoma chemoresistance, histocompatible C57BL/6 mice were inoculated i.m. or i.c. with control or PARP-1 silenced clones and treated with TMZ. The experiments show that animals bearing PARP-1-deficient melanoma cells are more susceptible to the antitumor effects of TMZ than mice challenged with PARP-1 proficient tumour cells. Moreover, GPI 15427 enhances growth inhibition induced by TMZ also in mice bearing PARP-1 silenced melanoma. Conclusions These results provide novel evidence for a direct role of PARP-1 in tumour aggressiveness and confirm the prominent role of PARP-1 protein in modulating chemosensitivity to methylating agents. Moreover, the data also suggest the involvement of PARP-2 in the repair of DNA damage provoked by these anticancer agents. This study underscores the importance of inhibiting PARP-1 and PARP-2 to render anticancer methylating agents more efficacious. Interestingly, in vivo chemosensitization achieved by stable silencing of the PARP-1 gene appeared to be superior to that obtained by pharmacological inhibition, suggesting that a prolonged and complete abrogation of PARP-1 activity besides compromising DNA repair activities might also affect tumour angiogenesis. Unlike pharmacological inhibitors, the lack of PARP-1 expression would hinder PARP-1 functions mediated by protein-protein interactions and this effect might also contribute to the increase chemosensitivity to methylating agents.

Le poli (ADP-ribosio) polimerasi-1 e -2 (PARP-1 e PARP-2) sono enzimi nucleari che sintetizzano polimeri di ADP-ribosio usando il NAD+ come substrato. Questi enzimi sono coinvolti nel riparo dei danni al DNA, nei processi di trascrizione, nella regolazione del ciclo e della morte cellulare. Numerosi studi in modelli animali knockout per PARP-1 e PARP-2, hanno dimostrato che questi enzimi hanno funzioni ridondanti, ma anche complementari nella salvaguardia e nel mantenimento dell’integrità genomica. In particolare, PARP-1 e -2 sono componenti essenziali del Base Excision Repair (BER), responsabile del riparo dei danni al DNA indotti dalle radiazioni e da agenti alchilanti monofunzionali (metilanti). La temozolomide (TMZ) è un agente metilante ad ampio spettro che è stato approvato per il trattamento dei gliomi ricorrenti ad alto grado di malignità ed è attualmente in corso di valutazione per il trattamento delle metastasi cerebrali dei tumori solidi (ad esempio il melanoma). A differenza del suo analogo dacarbazina, farmaco di riferimento per il trattamento del melanoma metastatico, la TMZ è una molecola lipofila e questa proprietà ne determina la biodisponibilità orale e la capacità di attraversare la barriera ematoencefalica. Le proprietà farmacocinetiche, il profilo tossicologico favorevole e l’attività antitumorale contro un ampio spettro di tumori fanno della TMZ un chemioterapico di notevole interesse. Tuttavia, la rapida insorgenza di resistenza al trattamento con la TMZ ne diminuisce i benefici a lungo termine. Il meccanismo d’azione della TMZ consiste nella generazione di un ampio spettro di addotti metilici: N7-metilguanina (N7-MeG), N3-metiladenina (N3-MeA) e O6-metilguanina (O6-MeG). L’O6-MeG è considerata la principale lesione citotossica e mutagena, anche se è prodotta in piccole quantità. Infatti, esiste una correlazione inversa tra la sensibilità alla TMZ e i livelli di O6metilguanina DNAmetiltransferasi (MGMT), un enzima che rimuove selettivamente il metile dalla posizione O6 della guanina. Se non riparata dal MGMT, l’O6-MeG si appaia in modo errato con la timina o la citosina e questo appaiamento innesca l’intervento del MisMatch Repair System (MMR). Tuttavia il MMR non ripara il danno e i ripetuti cicli di escissione e resintesi della base appaiata in modo erroneo con l’O6-MeG provocano rotture a doppio filamento del DNA, da apoptosi o arresto della crescita cellulare. Il grado di sensibilità delle cellule tumorali agli agenti metilanti è influenzato, quindi, dall’attività della MGMT e dal funzionamento del MMR. Le N-metilpurine non contribuiscono, invece, alla citotossicità della TMZ; esse sono, infatti, escisse dalla N-metilpurina DNA glicosilasi, (MPG). Successivamente il nucleotide danneggiato è sostituito grazie all’intervento coordinato di PARP-1 e -2 e degli altri componenti del BER. Gli inibitori di PARP sono risultati in grado di potenziare la chemio-sensibilità di tumori resistenti a causa di elevati livelli di MGMT o di alterazioni funzionali di MMR. La maggiore efficacia degli agenti metilanti ottenuta in seguito all’inibizione di PARP è dovuta all’aumento del danno a livello del DNA, come risultato di un’alterazione del BER dopo la rimozione iniziale della base metilata ad opera della MPG. Attualmente gli inibitori di PARP sono in fase di sperimentazione clinica come adiuvanti della chemioterapia per il trattamento del melanoma metastatico. Oltre che nel riparo del DNA, PARP-1, svolge un ruolo chiave anche nell’infiammazione, durante la quale si ha la produzione di specie ossidanti che causano danni al DNA e iperattivazione di PARP-1. Questo determina un elevato consumo di NAD+, necessario alla sintesi dei polimeri di (ADP-ribosio), con conseguente consumo di ATP. Inoltre PARP-1 aumenta l’attività di fattori di trascrizione che regolano l’attività di mediatori infiammatori, di molecole di adesione e di citochine coinvolte nelle risposte del sistema immunitario. É noto che l’infiammazione contribuisce allo sviluppo e alla progressione di molti tipi di tumori; inoltre i linfociti, i macrofagi e le cellule tumorali producono una serie di citochine proinfiammatorie. Le citochine, a loro volta, possono favorire il processo tumorigenico aumentando la regolazione di mediatori dell’angiogenesi come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Recentemente, abbiamo dimostrato ch PARP-1 è direttamente coinvolto nel processo angiogenico come indicato dalla ridotta formazione di vasi sanguigni in risposta a stimoli angiogenici in topi knockout per PARP-1, o da parte di cellule endoteliali umane trattate con inibitori di PARP. Obiettivi Lo scopo del presente lavoro è stato: • confrontare l’influenza del silenziamento dell’espressione di PARP-1, attraverso la metodica di RNA interference (RNAi), con l’inibizione farmacologica dell’attività PARP, sulla chemio-sensibilità delle cellule tumorali alla TMZ e a MeOSO2(CH2)2-lexitropsin (Me-Lex), un composto sperimentale che genera selettivamente N3-MeA; • studiare le modificazioni del ciclo cellulare indotte dai trattamenti con gli agenti metilanti in combinazione con gli inibitori di PARP e la modulazione delle proteine che regolano la progressione del ciclo; • Stabilire il ruolo di PARP-1 nell’aggressività e chemio-resistenza del melanoma, in vivo utilizzando i cloni stabilmente silenziati per l’espressione di PARP-1. Risultati Il silenziamento di PARP-1 nelle linee cellulari tumorali di melanoma o di carcinoma della cervice uterina silenziate, provoca un aumento di chemio-sensibilità a TMZ e Me-Lex, ed un incremento della percentuale di cellule in fase G2/M del ciclo cellulare rispetto ai cloni di controlli. Il GPI 15427, un potente inibitore dell’attività PARP-1 e PARP-2, oltre ad aumentare la sensibilità alla TMZ e al Me-Lex nelle cellule di controllo, determina un aumento di chemio-sensibilità anche nelle cellule silenziate per PARP-1. Il trattamento con TMZ o Me-Lex determina una più elevata fosforilazione di Chk-1, una chinasi coinvolta nell’arresto in G2/M, e dell’oncosoppressore p53 nelle cellule silenziate per PARP-1 rispetto alle cellule di controllo. La combinazione degli agenti metilanti con il GPI 15427 aumenta la fosforilazione di Chk-1 e p53 sia nelle cellule di controllo che in quelle silenziate per PARP-1. Sebbene le caratteristiche di crescita in vitro delle cellule silenziate per PARP-1 siano simili a quelle delle cellule di controllo, la loro tumorigenicità, in vivo, è significativamente ridotta rispetto a quella delle cellule che esprimono PARP-1. Infatti, i topi inoculati intramuscolo con le cellule silenziate per PARP-1 mostrano un ritardo nella formazione di noduli tumorali, che sono anche significativamente ridotti di volume, rispetto a quelli dei topi inoculati con i cloni di controllo. Inoltre, si osserva un aumento della sopravvivenza gli animali inoculati a livello intracranico con le cellule silenziate per PARP-1, rispetto ai topi inoculati con i cloni di controllo, in un modello che mima la localizzazione nel SNC del melanoma. L’analisi immunoistochimica degli espianti di melanoma silenziati per PARP-1 indica una riduzione dell’espressione del marcatore per l’angiogenesi PECAM/ CD31 e di proteine che intervengono modulando i processi infiammatori, che si accompagnano al tumore quali TNF-α e GITR. Allo scopo di studiare il ruolo di PARP-1 nella chemio-resistenza del melanoma in vivo, topi singenici per il melanoma murino B16 sono stati inoculati a livello intramuscolare o intracranico con linee silenziate per PARP-1 e trattati con TMZ. Come nel modello in vitro anche nel modello in vivo la chemiosensibilità alla TMZ dei tumori silenziati per PARP-1 è superiore rispetto a quella dei tumori di controllo. Inoltre, anche nel modello in vivo, il GPI 15427 aumenta ulteriormente l’inibizione della crescita indotta dalla TMZ persino nei topi inoculati con le cellule silenziate per PARP-1. Conclusioni Questi risultati forniscono nuove evidenze di un coinvolgimento diretto di PARP-1 nell’aggressività dei tumori a cui contribuisce, almeno in parte, la modulazione del processo angiogenico. I risultati confermano, inoltre, il ruolo di PARP- 1 nel riparo dei danni al DNA indotti dai metilanti e nella chemio-resistenza. Infine, l’ulteriore potenziamento della chemio-sensibilità da parte degli inibitori di PARP osservato nelle cellule silenziate per PARP-1, dimostra il coinvolgimento di PARP-2, o di altri enzimi PARP, nel riparo degli addotti metilici. Questi dati suggeriscono l’utilità di inibire sia PARP-1 che PARP-2 per aumentare l’efficacia della chemioterapia e per ridurre la progressione tumorale attraverso un meccanismo anti-angiogenico.