X-ray absorption spectroscopy: a powerful tool for structural studies of molecules involved in the pathogenesis of neurodegenerative diseases

This thesis describes the application of the X-ray Absorption Spectroscopy (XAS) to the study of biological systems that are particularly interesting for their biomedical role. Three classes of molecules, namely the Aβ peptides, the prion protein and the neuromelanin, which are related to the pathogenesis of neurodegenerative diseases, are studied by using a combination of XAS and other experimental techniques. Aβ peptides aggregates are the main component of the amyloid plaques, which are a peculiar lesion found in Alzheimer’s disease brains. The plaques have been shown to contain increased concentration of transition metals like Cu and Zn. Sedimentation assays, Fourier Transform Infrared Spectroscopy and XAS are used to determine the atomic structure around the metal binding site in samples where Aβ peptides are in complex with either Cu or Zn ions. The experiments show that Cu and Zn play different roles, and that Zn is more effective than Cu in promoting peptides aggregation. The prion protein is related to the pathogenesis of a class of infectious, neurodegenerative diseases. In particular, the conversion of the prion protein from its normal cellular form to the so-called scrapie form is responsible for the transmissible spongiform encephalopathies, and it has been shown that the prion protein is able to bind Cu and Zn ions in its N-terminal octarepeat domain. The XAS experiments reported in this thesis show that the Cu binding mode depends on the presence of Zn ions and, even if Zn is not able to displace Cu, Zn is able to change the way Cu is bound to the prion protein. Neuromelanin is a complex molecule accumulating in the neurons that undergo a degenerative process in Parkinson’s Disease. XAS is employed to investigate the sulphur binding mode in natural human neuromelanin, in synthetic melanins and in certain structurally known model compounds, namely cysteine and trichochrome C. Based on comparative fits of human and synthetic neuromelanin spectra in terms of those of model compounds, the occurrence of both cysteine- and trichochrome-like sulphur coordination modes is recognized and the relative abundance of these two types of structural arrangement is determined. Finally, XAS is used to study a biomedical problem not connected to neurodegenerative diseases, that is the prolidase deficiency. Human prolidase is a metalloenzyme that is important in the latest stages of protein catabolism. XAS is employed here to obtain a structural characterization of the Mn and Zn binding sites and shows the existence of heterogeneous dimeric metallic sites in the active form of the protein.

Questa tesi descrive l’applicazione della spettroscopia di assorbimento dei raggi X allo studio di sistemi biologici che sono particolarmente interessanti per la loro rilevanza biomedica. Si usa una combinazione della XAS e di altre tecniche sperimentali per studiare tre classi di molecole (i peptidi Aβ, la proteina prionica e la neuromelanina) coinvolte nella patogenesi delle malattie neurodegenerative. I peptidi Aβ sono la principale componente delle placche amiloidi, che costituiscono una delle lesioni caratteristiche osservate nel cervello dei malati di Alzheimer. È stato osservato che le placche amiloidi contengono elevate concentrazioni di ioni metallici quali Cu e Zn. Si effettuano misure di densità ottica, di spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier e di XAS per determinare la struttura atomica locale dei siti di legame dei metalli. Gli esperimenti mostrano che Cu e Zn hanno ruoli diversi nel processo di aggregazione, ed in particolare che lo Zn è più efficace del Cu nel promuoverla. La proteina prionica è coinvolta nella patogenesi di una classe di malattie neurodegenerative infettive. In particolare, la conversione di questa proteina dalla sua forma normale alla cosiddetta forma scrapie causa l’enecefalopatia spongiforme trasmissibile. Si è osservato che la regione N-terminale della proteina prionica ha un’elevata affinità per metalli quali Cu e Zn. Gli esperimenti XAS descritti in questa tesi mostrano che il modo di coordinazione del Cu dipende dalla presenza di ioni Zn e che, pur non essendo lo Zn in grado di rimuovere il Cu legato alla proteina, è in grado di modificarne il modo di coordinazione. La neuromelanina è una molecola che si accumula nei neuroni soggetti a processi neurodegenerativi nelle persone affette dalla malattia di Parkinson. La XAS è qui utilizzata per studiare la coordinazione dello zolfo nella neuromelanina umana, in alcune melanine sintetiche ed in due composti modello contenenti zolfo, la cisteina ed il tricocromo C. Sulla base di fit della neuromelanina umana e delle melanine sintetiche in termini dei composti modello, si riconosce la presenza di modi di coordinazione dello zolfo simili a quelli sia della cisteina, sia del tricocromo, e si quantifica la loro abbondanza relativa. Infine, la XAS è utilizzata per studiare un problema non connesso alla patogenesi di una malattia neurodegenerativa, ovvero la mancanza di prolidasi. La prolidasi umana è un enzima importante nelle fasi finali del metabolismo delle proteine, e la sua carenza o il suo mancato funzionamento sono alla base di una grave malattia. Nel presente tesi si usa la XAS per determinare il sito di legame di Mn e Zn, mostrando la presenza di un sito di legame dimetallico nella forma attiva della proteina.