The human interaction network mediated by Src Homology-3 domains: enriching the viral-host interactomes with interactions mediated by Src Homology-3 domains

Protein-protein interactions play an essential role in the regulation of most cellular processes. The ability of proteins to form functional complexes is in part supported by families of conserved protein domains that are specialized in mediating interactions with relatively short linear peptide motifs. An important subclass of these motifs, those that are characterized by the high proline content, play a pivotal role in biological processes requiring the coordinated assembly of multi-protein complexes. This is achieved via interaction with proteins containing modules such as Src Homology-3 (SH3) that are specialized in recognizing specific proline rich patterns. To characterize the interactome defined by poly-proline binding domains we have used a variant of the WISE (Whole Interactome Scanning Experiment) approach where pre-synthesized, naturally occurring, peptides are arrayed at high density on a glass surface. By this method we have tested a collection of 90 SH3 domains for their binding to a set of 9600 poly-proline containing peptides immobilized on a glass chip. To evaluate the quality of the obtained dataset, we performed a series of pull down experiments. The results validated more than 90% of the peptide-domain interactions. The protein-peptide interactions were also assayed with a library of M13 filamentous phages in which the gene for the VIII coat protein is fused to random 9-mer peptides. In order to evaluate the false positive rate of our experiments we carried out SPOT synthesis assays in which the peptides interacting with some SH3 domains were re-synthesized and probed with the protein fusions. Peptide chips, pull down assays, SPOT synthesis and phage display experiments allowed us to determine the specificity and promiscuity of proline-rich binding domains and to map their interaction network. All the predicted interactions were collected and stored in the PepspotDB (http://mint.bio.uniroma2.it/PepspotDB/), a bioinformatic resource developed in our lab for this purpose. Many viral pathogenic strategies involve targeting and perturbing host protein interactions. The characterization of the host protein sub-networks disturbed by invading viruses is a major goal of viral research and may contribute to reveal fundamental biological mechanisms and to identify new therapeutic strategies. To assist in this approach we have developed a database, VirusMINT, that stores in a structured format most of the published interactions between the viral and the host proteome. Although SH3 are the most ubiquitous and abundant class of protein binding modules, VirusMINT contains only a few interactions mediated by this domain class. To overcome this limitation we have applied the WISE (Whole Interactome Scanning Experiment) approach to identify interactions between 15 human SH3 domains and viral proline-rich peptides of two oncogenic viruses, HPV (Human papillomavirus type 16) and Ad12 (Human adenovirus A type 12). This approach identified 114 new potential interactions between the human SH3 domains and proline rich regions of the two viral proteomes.

Le interazioni fisiche e funzionali che avvengono fra le proteine all’interno della cellula hanno un ruolo essenziale nella regolazione di molti processi cellulari. La capacità delle proteine di formare complessi funzionali è in parte supportata da famiglie di domini proteici conservati, specializzati nel mediare interazioni con brevi motivi peptidici lineari. Un ruolo cruciale nei processi biologici che richiedono l’assemblaggio coordinato di complessi multi proteici è svolto da una sottofamiglia di motivi proteici, caratterizzati da un’elevata frequenza dell’amminoacido prolina, che mediano il riconoscimento e l’interazione con proteine contenenti particolari moduli proteici, come i domini Src Homology-3 (SH3), specializzati nel riconoscere specifici motivi ricchi in prolina. Per descrivere l’insieme delle interazioni definito dai domini di riconoscimento a sequenze ricche in prolina nel proteoma umano è stato utilizzato una variante dell’approccio WISE (Whole Interactome Scanning Experiment) in cui i peptidi pre-sintetizzati sono stati stampati ad alta densità su una superficie di vetro. Con questo metodo abbiamo testato la capacità di legame di 90 domini SH3 umani su un insieme di circa 9600 peptidi ricchi in prolina immobilizzati su una superficie di vetro (microarray di peptidi). Per verificare la qualità delle interazioni ottenute sono stati effettuati alcuni saggi di pull down in cui il dominio SH3 in fusione alla proteina GST è stato usato per precipitare lo specifico interattore predetto dai microarray di peptidi da estratti proteici di linee cellulari umane; questi saggi confermano più del 90% delle interazioni peptide-dominio. Alcune di queste interazioni sono state testate anche tramite esperimenti di phage display in cui una libreria di fago filamentoso M13, che espone sulla superficie capsidica dei nonameri di sequenza casuali fusi al gene della proteina pVIII, è stata utilizzata per arricchire i fagi che espongono delle sequenze specifiche per alcuni domini SH3. Il tasso di peptidi falsi positivi, che vengono selezionati negli esperimenti di microarray, è stato verificato con esperimenti di “SPOT synthesis” in cui i peptidi positivi di alcuni domini SH3 sono stati sintetizzati a bassa densità su membrane di cellulosa e successivamente testati per la loro capacità di legare il dominio SH3 specifico fuso alla proteina GST. Questi quattro approcci sperimentali ci hanno permesso di determinare la specificità e la promiscuità dei domini che legano regioni ricche in prolina e di descrivere il loro network d’interazioni proteiche. Le interazioni predette tramite questo approccio sono state collezionate in un apposito database chiamato PepspotDB (http://mint.bio.uniroma2.it/PepspotDB/), una risorsa bioinformatica sviluppata nel nostro laboratorio per raccogliere e analizzare grandi quantità di dati provenienti da esperimenti di questo tipo. Durante il loro ciclo riproduttivo i virus utilizzano strategie che coinvolgono e perturbano la rete delle interazioni proteiche della cellula ospite. La caratterizzazione della rete delle interazioni proteiche della cellula umana che viene alterata in seguito all’infezione virale, quindi, è un obbiettivo importate che potrebbe contribuire a delucidare i meccanismi biologici fondamentali del ciclo virale e ad identificare nuove strategie terapeutiche. A questo scopo nel nostro laboratorio è stato sviluppato un database, VirusMint, che colleziona la maggior parte delle interazioni tra proteine virali e umane pubblicate in letteratura. Sebbene i domini SH3 appartengano ad una classe di moduli di interazione proteica ubiquitaria e abbondante, VirusMint contiene un esiguo numero di interazioni mediate da questa classe di domini. Per superare questa limitazione abbiamo applicato l’approccio WISE per identificare nuove interazioni tra 15 SH3 umani e i peptidi ricchi in prolina di due virus oncogenici, HPV (Human papillomavirus type 16) e Ad12 (Human adenovirus A type 12). Gli esperimenti hanno identificato 114 nuovi potenziali interazioni tra i domini SH3 umani in esame e le regioni ricche in prolina dei due proteomi virali in esame.