Studio clinico e genetico-molecolare in paraparesi spastiche ereditarie ad esordio precoce

The hereditary spastic paraplegias (HSPs) are an etiologically heterogeneous group of neurological disorders which results from the selective degeneration of upper motor neurons (UMNs), of which key diagnostic clinical findings are spasticity and pyramidal weakness of lower limbs. HSP can be classified clinically according to mode of inheritance, age of onset or clinical phenotype. The disorder is inherited most often as an autosomal dominant trait, with autosomal recessive and X-linked inheritance occurring rarely and very rarely, respectively. Few epidemiological studies of HSP have been done, but prevalence is estimated at 3–10 cases per 100 000 population in western countries, in which approximately ADHSPs account for 80% of all HSPs (with SPG4 and SPG3A being the most common forms). Although genetically diverse with 46 genetic loci for HSP (of which 5 reserved) and 20 genes identified, it is often difficult to separate the disorders on clinical grounds. This phenotypic uniformity perhaps reflects a final common pathway in the disease process which results in degeneration of the corticospinal tracts and posterior columnes. Advances in recent years identifying the genes at half of these loci have suggested that disruption in any of the following: axonal transport, cytoskeleton regulation, mitochondrial function, myelin maintenance and assembly and neuronal migration may cause axonal damage in HSP. This study aims at genetic-molecular investigation of families affected by early onset forms of ADHSP, ARHSP, and apparently sporadic cases, as with “uncomplicated” or “complicated” clinical phenotype. Two point linkage analyses were performed in a ADHSP family to 8 known autosomal dominant loci (SPG3A, SPG4, SPG6, SPG8, SPG10, SPG12, SPG13, SPG31). The data indicated that the disorder in this kindred was linked to the known HSP locus SPG3A. Sequencing the SPG3A gene coding exons and flanking intronic regions disclosed a novel heterozygous missense mutation in exon 12 at nucleotide c.1246 C>T (p.Arg416Cys). The Arginine 416 is highly conserved among species. I analysed the coding region and exon–intron boundaries of 3 “early onset” HSP genes, SPG3A, SPG5A and SPG42, by direct sequencing in a total serie of 9 unrelated autosomal dominant and 3 autosomal recessive hereditary spastic paraplegia index patients, and in 18 unrelated index patients with apparently sporadic hereditary spastic paraplegia, manifesting either pure or complex forms of the disease. Multiplex ligation-dependent probe amplification performed in SPG3A candidate patients (probe mixtures P165-HSP-B1, MRC-Holland, The Netherlands) did not detect any pathogenic changes. By direct sequencing I identified five, including three novel, mutations, one segregating in two unrelated families, the others in apparently sporadic cases. Four of these mutations were missense: c.1246 C>T (p.R416C) and c.1243 C>T (p.R415W) in SPG3A gene, c. 995 T>C (p.F264S) and c.344C>T (p.S115F) in SPG5A gene. One resulted in a frameshift with the introduction of a premature stop codon at the C-terminal of the protein: c.1362insT (p.A453CfsX470) in SPG5A gene. Any pathogenic changes was detected in SPG42 gene. Interestingly, both early-age onset and possible anticipatory phenomena were observed in the two families showing mutation p.R416C in ATL1. These results confirm data observed in literature according to which the SPG3A and SPG5A genes show an high mutational frequency in early onset forms of ADHSP and ARHSP (respectively 20% and 7%) and apparently sporadic cases.

Le paraparesi spastiche ereditarie (HSPs) rappresentano un gruppo eterogeneo di disturbi neurologici con interessamento del motoneurone superiore (UMND) la cui caratteristica clinica prevalente è la spasticità e l’ipostenia piramidale degli arti inferiori. HSP può essere classificata clinicamente in accordo alla modalità di ereditarietà, età di insorgenza o il fenotipo clinico. Questo disturbo è ereditato più spesso secondo la modalità autosomica dominante, meno frequentemente con ereditarietà autosomica recessiva e raramente secondo modalità di trasmissione X-linked. Pochi studi epidemiologici sono stati condotti sulle HSPs, ma la prevalenza è stimata tra 3-10:100 000, di cui le forme di HSP ad ereditarietà autosomica dominante costituiscono circa l’80% dei casi nei paesi Occidentali (con le forme più comuni in SPG4 e SPG3A). A dispetto di una eterogeneità genetica con 46 loci genetici (di cui 5 riservati) e 20 geni identificati, è più difficile separare le diverse entità nosografiche sul piano clinico. Questa uniformità fenotipica forse riflette un pathway finale comune nei processi della malattia da cui esita una degenerazione retrograda assonale dei tratti cortico-spinali e delle colonne posteriori. Studi recenti hanno permesso di identificare i geni di circa la metà di questi loci, suggerendo un’interruzione a più livelli come possibile causa di danno assonale: nel trasporto assonale e nella regolazione citoscheletrica, nelle funzioni mitocondriali, nel mantenimento e assemblaggio della mielina e nella migrazione neuronale. Questo studio ha l’obiettivo di effettuare un’indagine genetico-molecolare di famiglie affette da forme ad esordio precoce di ADHSP, ARHSP e casi apparentemente sporadici, sia con fenotipo clinico “non complicato” che “complicato”. Uno studio di linkage a 2 punti è stato effettuato in una famiglia ADHSP per 8 loci noti autosomico dominanti (SPG3A, SPG4, SPG6, SPG8, SPG10, SPG12, SPG13, SPG31). I risultati indicano che il disturbo in questa famiglia era legato al locus noto SPG3A. Attraverso il sequenziamento diretto degli esoni codificanti e delle regioni fiancheggianti gli introni del gene SPG3A è stata individuata una nuova mutazione missenso nell’esone 12 al nucleotide c.1246 C>T (p.R416C). La Arginina 416 è altamente conservata tra le specie. Ho analizzato i 3 geni HSP ad esordio precoce, SPG3A, SPG5A and SPG42, attraverso l’analisi di sequenziamento diretto nel restante campione composto dai probandi di 9 famiglie non imparentate autosomico dominanti, 3 autosomico recessive e 18 pazienti con paraplegia spastica apparentemente sporadica, con forme pure e complesse di malattia. L’analisi MLPA effettuata nei pazienti candidati per SPG3A (kit P165-HSP-B1, MRC-Holland) non ha individuato nessun cambiamento patogenetico. Attraverso il sequenziamento diretto ho evidenziato cinque mutazioni, di cui tre nuove, una che segrega in due famiglie non imparentate e le altre in casi apparentemente sporadici. Quattro di queste mutazioni sono missenso: c.1246 C>T (p.R416C) e c.1243 C>T (p.R415W) nel gene SPG3A, c.995 T>C (p.F264S) e c.344C>T (p.S115F) nel gene SPG5A. Una è un’inserzione che esita in un frameshift con l’introduzione di uno stop prematuro al codone C-terminale della proteina: c.1362insT (p.A453CfsX470) nel gene SPG5A. Nessun cambio patogenetico è stato individuato nel gene SPG42. È interessante che sia l’esordio precoce sia possibili fenomeni di anticipazione genetica siano stati osservati nelle due famiglie che presentano la mutazione p.R416C in ATL1. Questi risultati confermano i dati osservati in letteratura per cui i geni SPG3A e SPG5A mostrano un’alta frequenza mutazionale nelle forme ad esordio precoce di ADHSP e ARHSP (rispettivamente il 20 e il 7%) e nei casi apparentemente sporadici.