Effetto dei campi elettromagnetici a frequenza estremamente bassa sul differenziamento neuronale di cellule AtT20 e NTera-2

The first aim of this thesis was to establish whether exposure to an extremely low frequency electromagnetic field (ELF-EMF) at a frequency of 50Hz and magnetic flux density of 2 milli Tesla (mT) could affect the cellular and molecular biology of AtT20/D16V cell line. The mouse pituitary corticotrope-derived AtT20 cells spontaneously differentiate after 5 days of culture in peptidergic-like neurons. Intracellular calcium ([Ca2+]i) and pH (pHi) were monitored by ratiometric fluorescent probes Indo-1 and SNARF respectively. Single-cell fluorescence microscopy showed a statistically significant increase in [Ca2+]i followed by a drop in pHi in exposed cells. Both scanning (SEM) and transmission (TEM) electron microscopy analysis of 24 hours exposed cells showed morphological changes in plasma membrane compared to control ones. These modifications came with a rearrangement in actin distribution and the emergence of peptidergic neurons features like the increase in synaptic vesicles marker, synaptophysin, and electron-dense granules in the cytosol. Neurofilament protein NF-200 immunostaining and PCR analysis gave additional evidences that exposed cells were in a more advanced stage of differentiation compared to control. Pre-treatment with a specific L-type Ca2+ channel blocker, Nifedipine, prevented NF-200 expression in the exposed cells. The above findings demonstrate that exposure to 50Hz, 2mT ELF-EMF is responsible for the precocious differentiation of AtT20 cells. Moreover I reported the preliminary results about the exposure effects of a human teratocarcinoma cell line to a 29Hz, 1mT extremely low frequency electromagnetic field. When NTera2 cl.D1 cells were allowed to form neurospheres they differentiated in (central nervous system) neurons after 14 days of Retinoic Acid (RA) treatment (1μM). Afterwards the aggregated cells were plated on matrigel in AraC and analysed by phase contrast microscopy. The RA differentiated cells had a typical neuronal morphology, small cell bodies with two or more elongated processes. The 29Hz, 1mT ELF-EMF is able to induce to a certain extent the differentiation of NT2 exposed cells visible as growth of neurites respect to control ones. Cell Cycle Analysis by Propidium Iodide staining showed, in the same way as in RA treated neurospheres, an increase in cells percentage in G1/G0 phase in exposed NT2 at 14th and 21st days. Real Time PCR analysis on early (NeuroD, Nestin) and late (NR1, TAU) neuronal development genes gave additional evidences about the ELF-EMF effect on NT2 differentiation. All neuronal markers were up regulated in exposed cells compared to control and, except for NeuroD, the expression trends followed the same pattern found in RA treated cells. The gradual increase in NeuroD mRNA together with the previous results made hypothesize that a 29Hz, 1mT ELF-EMF induce neuronal differentiation in NT2 cells in a different way in respect to the chemical treatment by Retinoic Acid suggesting a slower and continuous effect.

Il primo obiettivo di questa tesi è stato quello di determinare se l’esposizione ad un campo elettromagnetico a frequenza estremamente bassa (ELF-EMF) di 50Hz ed intensità di flusso magnetico di 2milli Tesla (mT) fosse in grado di influenza la biologia cellulare e molecolare della linea cellulare AtT20/D16V. Le cellule corticotrope pituitarie di topo AtT20/D16V differenziano spontaneamente dopo 5 giorni di coltura in neuroni simil-peptidergici. I valori della concentrazione dello ione calcio ([Ca2+]i) ed il pH (pHi) intracellulari sono stati monitorati tramite sonde raziometriche fluorescenti Indo-1 e SNARF. L’analisi di fluorescenza su singola cellula ha messo in evidenza che l’esposizione al campo ELF-EMF determina un aumento di [Ca2+]i seguito da una diminuzione del pHi. Le analisi effettuate al microscopio elettronica a scansione (SEM) e a trasmissione (TEM) mostrano come l’esposizione ad un campo magnetico di 50Hz, 2mT di 24 ore determini cambiamenti morfologici nella membrana plasmatica e variazioni nella distribuzione della actina citoscheletrica rispetto ai controlli. Inoltre si osserva l’insorgenza delle caratteristiche dei neuroni peptidergici quali un aumento del marcatore delle vescicole sinaptiche, la sinaptofisina, e dei granuli elettron densi nel citosol. La rilevazione della proteina dei neurofilamenti NF-200 mediante marcatura con anticorpo monoclonale e l’analisi tramite PCR hanno ulteriormente evidenziato che le cellule esposte si trovano in una fase più avanzata del differenziamento rispetto ai controlli. Il pretrattamento con uno specifico bloccante dei canali del calcio di tipo L, la Nifedipina, previene l’espressione di NF-200 nelle cellule esposte. Questi risultati mostrano che l’esposizione ad un campo ELF-EMF di 50Hz, 2mT determina un precoce differenziamento delle cellule della linea AtT20/D16V. Inoltre sono stati riportati i risultati preliminari sugli effetti dell’esposizione ad un campo di 29Hz, 1mT su una linea di teratocarcinoma umano. Quando le cellule NTera2 cl.D1 vengono fatte aggregare in neurosfere possono essere indotte a differenziare in neuroni del sistema nervoso centrale in soli 14 giorni mediante trattamento con Acido Retinoico 1μM (RA). Gli aggregati sono stati piastrati su matrigel in presenza di AraC e analizzati a contrasto di fase. Le cellule differenziate in RA assumono la tipica morfologia dei neuroni, piccoli corpi cellulari con due o più prolungamenti. Il campo ELF-EMF di 29Hz 1mT è in grado di indurre un parziale differenziamento delle cellule esposte e questo è visibile dalla crescita di neuriti non presenti invece nei controlli. L’analisi del ciclo cellulare mediante marcatura con Ioduro di Propidio mostra nei campioni esposti, in maniera simile ai campioni trattati con RA, un aumento della percentuale delle cellule nella fase G1/G0. L’analisi mediante Real Time PCR di marcatori del differenziamento neuronale precoci (NeuroD, Nestin) e tardivi (NR1, TAU) offre evidenze aggiuntive sull’effetto del campo ELF-EMF sul differenziamento delle NT2. Tutti i marcatori analizzati sono risultati essere up regolati in seguito all’esposizione al campo rispetto ai controlli e l’andamento dell’espressione, ad eccezione di NeuroD, segue quello delle cellule trattate con RA. L’aumento graduale dell’mRNA di NeuroD insieme ai risultati sopra illustrati porta ad ipotizzare che un campo ELF-EMF di 29Hz, 1mT sia in grado di indurre il differenziamento delle cellule NT2 in maniera più lenta ma costante rispetto al trattamento chimico con Acido Retinoico.