Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) : identification of new substrates and new potential mechanisms of modulation of the Ras pathway

Protein tyrosine phosphatases play a crucial role in signal transduction. To advance our understanding of the network based on this enzyme family, we have developed a combined experimental and computational approach to correctly place the tyrosine phosphatases in the context of a functional human interactome. We have applied this strategy to the identification of new PTP1B phosphatase substrates. We have used a Bayesian approach to integrate information about substrate preference, as determined by probing high density phospho-peptide chips, and distance in the human protein interaction network to rank phospho-proteins according to likelihood of being PTP1B substrates. By focusing on the proteins involved in the EGFR pathway, we identified PLC-, Gab1 and SHP2 as putative PTP1B substrates. A variety of in vitro and in vivo approaches were used to validate this prediction. The activity of PTP1B on PLC-, Gab1 and SHP2 tyrosine phosphorylation were also confirmed by phosphatase over-expression and siRNA knock down experiments. TC-PTP, the closest PTP1B homologue, does not dephosphorylate PLC-, Gab1 and SHP2, demonstrating a specificity of PTP1B towards these three substrates. In addition we demonstrated that PTP1B over-expression negatively affects the EGF induced association between Gab1 and SHP2 proteins leading to a decrease of MAP kinase activation. We also provide evidence of a physical association between Gab1, PTP1B and the docking protein Grb2 to form a ternary complex.

Le fosfatasi a tirosina giocano un ruolo importante nella regolazione delle vie di trasduzione del segnale. Abbiamo sviluppato un approccio computazionale ed uno sperimentale, volti all’identificazione di nuovi substrati della fosfatasi a tirosina umana PTP1B. Un approccio Bayesiano ha permesso di integrare i due tipi di informazione: la specificità di substrato di PTP1B, ottenuta da esperimenti di microarray e la distanza nel network di interazione proteica tra PTP1B e qualsiasi altra proteina appartenente all’interattoma umano. Focalizzandoci sulle proteine coinvolte nel “pathway” indotto dal fattore di crescita epidermico (EGF), abbiamo identificato PLC1, GAB1 ed SHP2 come possibili substrati di PTP1B. Per validare queste predizioni abbiamo effettuato sia esperimenti “in vitro” che “in vivo”. L’over-espressione di PTP1B comporta una diminuzione della fosforilazione in tirosina dei substrati predetti mentre la diminuzione della espressione della fosfatasi, ottenuta utilizzando RNA interference, determina un aumento della fosforilazione in tirosina delle tre proteine analizzate. Abbiamo quindi verificato la specificità di riconoscimento di PTP1B; infatti, TCPTP, la fosfatasi a tirosina omologa a PTP1B, non è in grado di defosforilarne i substrati. Inoltre, abbiamo dimostrato che PTP1B, defosforilando GAB1, regola negativamente l’associazione EGF-dipendente di GAB1 con SHP2 portando a una diminuzione dell’attività delle MAP kinasi. Abbiamo quindi fornito evidenze sia riguardo la possibile formazione di un complesso terziario tra GAB1, GRB2 e PTP1B, sia riguardo un modello per interpretare l'attività antiproliferativa di PTP1B.