TIMP3: un nuovo biomarcatore di aterosclerosi nel Diabete Mellito di tipo 2: studi in vivo ed in vitro

Atherosclerosis is accelerated in patients with Type 2 Diabetes Mellitus (DM2) by unknown mechanisms. We identified Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 3 (TIMP3), the endogenous inhibitor of A Disintegrin and Metalloprotease Domain 17 (ADAM17) and other Matrix MetalloProteinase (MMP), as a gene modifier for insulin resistance and vascular inflammation in mice. Therefore we hypothesized that an increased activity of the ectodomain shedding process, due to a dysregulation of ADAM17/Timp3 dyad, may be a common factor linking progression of atherosclerosis to insulin resistance and diabetes. Here we also tested TIMP3 association with atherosclerosis in patients with type 2 diabetes mellitus (DM2) and identified Sirtuin 1 (SirT1) as a major regulator of TIMP3 expression. ADAM17 substrates, such as soluble (s)ICAM-1, sVCAM-1, sIL6R, sCXCL16 and sTNFR1, were analyzed in serum from healthy subjects (CT, n=70), patients with Carotid Atherosclerosis (CAR-ATS, n=35) and patients with Coronary Artery Disease (CAD, n=170). Moreover we investigated ADAM10/17, MMP9, TIMP1/2/3/4 expression levels in human carotid atherosclerotic plaques (n=60) from subjects with and without diabetes. Human Vascular Smooth Muscle cells exposed to several metabolic stimuli were used to identify regulators of Timp3 expression. SirT1 small interference RNA (siRNA), cDNA and TIMP3 promoter gene reporter were used to study SirT1 dependent regulation of TIMP3. We found that, among soluble ADAM17 substrates, sCXCL16, sICAM-1 and sVCAM1 were differently and significantly increased according to location of vascular disease and impairment of glucose metabolism. We showed that in human carotid atherosclerotic plaques TIMP3 was significantly reduced in subjects with DM2 leading to ADAM17 and MMP9 overactivity. Reduced expression of TIMP3 was associated in vivo to SirT1 levels. In smooth muscle cells, inhibition of SirT1 activity and levels reduced TIMP3 expression, while SirT1 overexpression increased TIMP3 promoter activity. In conclusion, our data suggest that the ectodomain shedding process is gradually activated in patients with different location of atherosclerotic disease. Moreover in atherosclerotic plaques from subjects with Type 2 diabetes the deregulation of ADAM17 and MMP9 activities is related to inadequate expression of TIMP3 via SirT1. Studies in vascular cells confirmed the role of SirT1 in tuning TIMP3 expression.

Nei pazienti affetti da Diabete Mellito di Tipo 2 l’aterosclerosi è fortemente accelerata da meccanismi ancora oggi sconosciuti. Il nostro gruppo recentemente ha identificato l’Inibitore Tissutale delle Metalloproteinasi 3 (TIMP3), che è l’inibitore endogeno dell’enzima TNF Converting Enzyme (TACE), anche chiamato A Disintegrin and Metalloproteasi Domain 17 (ADAM17) e di altre MetalloProteasi di Matrice (MMP), come un gene favorente lo sviluppo di insulino resistenza e infiammazione vascolare nel topo. Abbiamo quindi ipotizzato che un’aumentata attività del sistema proteolitico di membrana extracellulare, dovuta ad una alterata regolazione della diade ADAM17/TIMP3, possa essere un fattore comune allo sviluppo e progressione dell’aterosclerosi, dell’insulino resistenza e del diabete. Ulteriore scopo di questo lavoro è valutare l’associazione di TIMP3 con l’aterosclerosi in pazienti affetti da Diabete Mellito di Tipo 2 (DM2) ed identificare fattori in grado di regolare l’espressione di TIMP3. I substrati solubili circolanti di ADAM17/TACE, quali sICAM-1, sVCAM-1, sIL6R, sCXCL16 e sTNFR1, sono stati analizzati nei sieri di soggetti sani di controllo (CT, n=70), pazienti con Aterosclerosi Carotidea (CAR-Ats, n=35) e pazienti con Coronaropatia (CAD, n=170). Inoltre abbiamo valutato i livelli di espressione di ADAM10/17, MMP9, TIMP1/2/3/4 in placche aterosclerotiche carotidee umane (n=60) prelevate da pazienti con e senza diabete sottoposti ad Endoarteriectomia carotidea. Cellule muscolari lisce vascolari umane esposte a diversi stimoli metabolici sono state utilizzate per identificare i regolatori dell’espressone di Timp3. Il silenziamento genico di SirT1 mediante small interference RNA (siRNA), SirT1 cDNA e un vettore reporter per il promotore del gene TIMP3 sono stati usati per studiare la regolazione dell’espressione di TIMP3 da parte di SirT1. In questo lavoro abbiamo riscontrato che, fra i substrati solubili di ADAM17/TACE, sCXCL16, sICAM-1 e sVCAM1 sono differentemente e significativamente aumentati a seconda della localizzazione della patologia vascolare aterosclerotica e dell’alterazione del metabolismo glucidico. Abbiamo inoltre mostrato che nelle placche aterosclerotiche carotidee umane i livelli di espressione di TIMP3 sono significativamente ridotti nei soggetti con diabete mellito di tipo 2 con un conseguente aumento dell’attività di ADAM17/TACE e MMP9. La ridotta espressione di TIMP3 è stata associata in vivo ai livelli di SirT1. Nelle cellule muscolari lisce vascolari umane, l’inibizione dell’attività e dei livelli di SirT1 determina una riduzione dell’espressione di TIMP3, mentre una sovra-espressione di SirT1 aumenta l’attività del promotore di TIMP3. In conclusione, i nostri dati suggeriscono che il sistema proteolitico di membrana è gradualmente attivato in soggetti con differente localizzazione della patologia aterosclerotica. Inoltre nelle placche aterosclerotiche di soggetti con il diabete mellito di tipo 2 la deregolazione dell’attività di ADAM17/TACE e delle MMP9 è correlata con un’inadeguata espressione di TIMP3 SirT1-dipendente. Gli studi effettuati su cellule vascolari confermano il ruolo di Sirt1 nel modulare l’espressione di TIMP3.