Effect of nucleoside and nucleotide analogues on reverse transcriptase activity in primary isolates from HTLV-1 infected patients

In our laboratory it has been recently shown the capability of some nucleoside analogues to directly inhibit HTLV-1 reverse transcriptase (RT), prepared as a crude lysate from chronically infected MT-2 cells, by means of a novel cell-free assay. This assay is essentially based on a standard specific RT-PCR reaction, that utilizes RNA from transfectants ectopically expressing the glycoprotein D of HSV-1 as a template for reverse transcription. Thus we asked whether a similar assay could be utilized i) for assaying HTLV-1 RT activity in supernatants from PBMCs infected with HTLV-1, ii) for evaluating the inhibitory activity of compound of interest towards RT of HTLV-1 strains carried by HAM/TSP or ATLL patients. To this purpose, we utilized as a source of HTLV-1 RT crude cell-free preparations from i) supernatants of IL-2 dependent cell lines infected in vitro with HTLV-1 and maintained in long-term cultures, ii) supernatants of stimulated PBMCs from HAM/TSP or ATLL patients, enrolled in different therapeutic protocol, maintained in short-term culture. The RT-PCR reaction was performed in the presence of AZT, 3TC and some phosphonate-nucleosides (Tenofovir and new synthesized compounds), following activation with a cell-free extract from PBMC of normal donors. Results demonstrated that RT activity was actually detectable, using our RT-PCR assay, in supernatants from PBMCs infected in vitro with HTLV-1 as well as from PBMCs of TSP and ATLL patients. Moreover, we observed a variable response to the RT inhibitory activity of the different compounds. In fact AZT differently inhibited RT from TSP or ATLL patients, while it was equally active towards RT from different HTLV-1 infected cell lines. Conversely, TFV was not able to inhibit RT from TSP patients, while it variably inhibited RT from HTLV-1 infected cell lines. Finally, 3TC was completely unable in inhibiting RT activity from all supernatants tested. Interestingly, it was shown how primary isolates from HTLV-1 infected patients were more sensitive to newly synthesized compounds, PCOANs, in respect to the well known tenofovir. Furthermore, results indicated that the prolonged in vivo therapy did not result in reduced sensitivity of HTLV-1 RT to these nucleoside analogues. This work suggest that our novel HTLV-1 RT inhibition assay is very sensitive for rapidly and safely screening HTLV-1 RT activity from various samples.

E’ stata recentemente dimostrata nel nostro laboratorio la capacità di alcuni composti nucleosidici di inibire direttamente la trascrittasi inversa (RT) di HTLV-1, ottenuta in forma di lisato crudo da cellule della linea cronicamente infetta MT-2, mediante un saggio cell-free. Ai fini di un eventuale trasferimento clinico dei dati ottenuti, abbiamo voluto verificare se tale saggio potesse essere utilizzato per valutare: ì) l’attività dell’RT da colture di linfociti infettati con HTLV-1; ìì) l’attività inibitoria di composti nucleosidici verso l’RT di HTLV-1 ottenuta da colture di linfociti di pazienti TSP ed ATLL. A tale scopo abbiamo utilizzato come fonte di RT di HTLV-1: ì) supernatante di colture, IL-2 dipendenti, a lungo termine di linfociti di donatori sani infettati in vitro con HTLV-1, ìì) supernatante di linfociti di pazienti HTLV-1 positivi affetti da TSP o ATLL, arruolati in differenti protocolli terapeutici, mantenuti in culture a breve termine. Quali composti nucleosidici sono stati saggiati AZT, 3TC, Tenofovir (TFV) ed alcuni composti nucleosidici fosfonati di nuova sintesi. I risultati hanno mostrato che è effettivamente possibile evidenziare un’attività RT, utilizzando il nostro saggio, nel supernatante di colture di linfociti infettati in vitro con HTLV-1 o di pazienti TSP e/o ATLL positivi. Inoltre è stata osservata una diversa attività dei vari composti nucleosidici e nucleotidici a seconda della fonte di RT utilizzata. Infatti l’AZT inibiva in modo differente l’RT dei pazienti TSP e ATLL, mentre risultava ugualmente attiva nei confronti delle linee infettate in vitro con HTLV-1. Al contrario il TFV non inibiva l’RT proveniente dai pazienti, mentre risultava efficace a dosi variabili nell’inibire l’RT delle linee cronicamente infette. Il composto 3TC era totalmente incapace di inibire l’attività dell’RT di tutti i supernatanti testati. E’ interessante osservare che i composti carbociclici fosfonati di nuova sintesi mostravano una maggiore efficacia rispetto al TFV nell’inibire l’RT sia dei pazienti TSP che delle linee HTLV-1 positive. Per l’RT ottenuta dai pazienti TSP analizzati prima e dopo terapia, non è stata messa in evidenza alcuna differenza nella sensibilità alle diverse sostanze. In conclusione i nostri dati mostrano che il saggio di inibizione dell’RT di HTLV-1 messo a punto permette di effettuare uno screening rapido dell’attività dell’RT di HTLV-1 da campione di origine diversa e che tale saggio potrebbe essere quindi utilizzato per valutare l’attività inibitoria dei diversi composti direttamente sull’RT di pazienti infettati con HTLV-1.