Hepatitis E virus from molecular diagnosis to in vitro replication

Il virus dell’epatite E (HEV) è la principale causa di epatiti virali acute epidemiche nei paesi in via di sviluppo, con scarse condizioni igieniche, e causa di epatiti sporadiche nei paesi industrializzati. HEV infetta diverse specie animali, suino, cinghiale, cervo e mangoste, nella maggior parte dei casi asintomaticamente. In Europa, il genotipo 3 di HEV presenta un’elevata prevalenza nel suino e risulta strettamente correlato dal punto di vista genetico a ceppi identificati in casi sporadici umani nella stessa area geografica, suggerendo una possibile trasmissione zoonotica e alimentare. In questo studio e’ stata valutata la prevalenza dell’HEV nei maiali provenienti da sei allevamenti del Nord d’Italia, testando l’RNA fecale mediante nested-RT-PCR (RT: reverse transcription). Tutti gli allevamenti sono risultati positivi per la presenza di RNA genomico di HEV, con una prevalenza compresa tra il 12.8% e 72.5%. Le sequenze genomiche identificate sono state confrontate con altre sequenze di HEV di diversa origine identificate in tutto il mondo e sottoposte ad analisi filogenetica. In particolare un gruppo di 7 ceppi italiani suini confrontati con ceppi sia umani che suini europei, presentano una elevata identita’ di sequenza compresa tra il 91.6 e il 96.2%. La mancanza di un sistema di coltura cellulare per l’HEV ha fortemente ostacolato la scoperta delle vie di trasmissione del virus e l’analisi dettagliata del ciclo di replicazione nelle cellule infette. Nella seconda parte di questo studio, e’stato utilizzato un sistema di coltura cellulare rotante (RCCS) per la crescita del virus dell’HEV in vitro. RCCS e’ una tecnologia ottimizzata per crescere le colture cellulari in 3 dimensioni (3D) in condizioni che riproducono molte delle caratteristiche specifiche dei tessuti in vivo. In questi studi sono state utilizzate: cellule intestinali umane epiteliali (INT407 IFN KO) e cellule di rene di maiale (PK15 IFN KO), interferon knockout la cui risposta antivirale risulta modificata, linee cellulari umane di epatoma (PLC/PRF/5 e Hep G2/C3a). Ogni linea cellulare e’ stata inoculata con campioni risultati HEV positivi per PCR, provenienti da sospensioni fecali di maiali e con omogenati di fegato ed epatociti di un maiale sperimentalmente infettato con HEV. Esperimenti di real time RT-PCR sono stati utilizzati per identificare e quantizzare l’RNA virale nel terreno di coltura per tutto il periodo dell’infezione. Inoltre, mediante tecniche di RT-PCR, IPX, CM, SEM and TEM sono state valutate le differenze nell’espressione dei marcatori di differenziazione cellulare e di infezione virale (CK-8, CK-18, CK-19, IL-6, CytP450 e Albumin) tra le colture in configurazione 3D e le convenzionali colture in 2D delle stesse cellule. I risultati suggeriscono che gli aggregati 3D di cellule mostrano molte delle caratteristiche specifiche dei tessuti in vivo offrendo un nuovo approccio per lo studio della replicazione e della patobiologia virale paragonata all’analisi delle colture convenzionali in 2D delle stesse cellule.