Role of the HIV-1 Nef protein in the activation of infected CD4+ T lymphocytes

The replication of HIV-1 is closely linked to the activation state of the cells: in activated memory CD4+ T lymphocytes, HIV-1 readily undergoes multiple rounds of replication, whereas resting T cells are largely refractory to productive infection due to multiple early post-entry replication blocks. Reported evidences suggest that HIV-1 has evolved functions to contrast these blocks. In particular, the product of an early viral gene, Nef, is able to sensitize HIV-1-infected quiescent CD4+ T lymphocytes to activation thus favoring IL-2 production and viral replication in response to TCR stimulation. On the other hand, in productively infected T cells, Nef was shown to impair early activation events during synapse formation with antigen presenting cells that result in reduced release of IL-2. In addition, former studies have shown that Nef associates with several signaling proteins (e.g. Lck, Vav, PI3-K, PAK2), and affects the expression of the CD4 and CD28 co-receptors, but the functional consequences of these interactions in T cell activation is unclear. This study is focused on the function of the Nef protein in the activation of primary HIV-1-infected CD4+ T lymphocytes. First, the impact of HIV-1 infection, with or without Nef expression, on the steady-state levels and intracellular localization of Lck, CD4 and CD28 was analyzed in both resting and pre-activated CD4+ T lymphocytes. Next, the capacity of CD4+ T lymphocytes infected with wt or Nef-deficient virus to respond to primary and secondary TCR stimulation was investigated. Moreover, CD4 signaling and Lck activation was analyzed after CD4-cross-linking of quiescent T cells infected with wt or Nef-deficient HIV-1. Results show that, despite the steady-state levels of CD4 and Lck are reduced by Nef, the CD4 signaling pathway is preserved in latently infected resting CD4+ T lymphocytes. Upon activation via CD3/CD28 of HIV-1-infected quiescent T cells, early tyrosine-phosphorylated effector molecules as well as the down-stream NF-κB pathway are induced to the same extent and with the same kinetics in cells infected with wt virus, Nef-deficient virus, and uninfected cells. Conversely, secondary activation via CD3/CD28 of resting HIV-infected T cells, results in a Nef-dependent delay of PLC-γ1 phosphorylation. Finally, in activated HIV-1-infected T cells the dramatic down-regulation of surface CD4 induced by Nef and late viral proteins (Env, Vpu) as well as the Nef-dependent CD28 down-regulation, may account for the previously described Nef’s capacity to impair the formation of the immune synapse. Apparently, that Nef differentially regulates T cell activation depending on the intracellular environment: Nef enhances activation of quiescent cells to favour initial viral replication whereas it inhibits second rounds of TCR stimulation, possibly to avoid apoptosis that would restrict viral replication. The future identification of target molecules regulated by Nef is an important step for understaing how HIV-1 interferes with T cell function to facilitate viral spread.

La replicazione dell'HIV-1 è strettamente legata allo stato di attivazione delle cellule: in linfociti T CD4+ attivati, l'HIV-1 è in grado di replicarsi efficientemente, mentre cellule T quiescenti non consentono un' infezione produttiva a causa della presenza di vari blocchi della replicazione virale che intervengono subito dopo l'entrata del virus. Lavori precedenti suggeriscono che HIV-1 ha evoluto delle funzioni che gli consentono di superare questi blocchi. In particolare, il prodotto di un gene virale precoce, la proteina Nef, è in grado di rendere sensibili all'attivazione i linfociti T CD4+ quiescenti infettati con HIV-1 favorendo la produzione di IL-2 e la replicazione virale in risposta a stimolazione del TCR. In cellule T efficientemente infettate, è stato osservato che la proteina Nef compromette gli eventi precoci dell'attivazione cellulare durante la formazione della sinapsi con cellule presentanti l'antigene che si traduce in un ridotto rilascio di IL-2. Inoltre è stato precedentemente osservato che Nef si associa con diverse proteine del signaling (es. Lck, Vav, PI3-K, PAK2), ed altera l'espressione del CD4 e del CD28 anche se le conseguenze funzionali di queste interazioni nell'attivazione cellulare non sono chiare. Questo lavoro ha lo scopo di studiare la funzione della proteina Nef nell'attivazione di linfociti T CD4+ primari. Dapprima è stato analizzato l'effetto dell'infezione di HIV-1, in presenza o in assenza della proteina Nef, sul livello basale e sulla localizzazione intracellulare di Lck, CD4 e CD28, sia in linfociti T CD4+ quiescenti che pre-attivati. Successivamente è stata analizzata la capacità dei linfociti T CD4+ infettati con virus wt o ΔΝef di rispondere a stimolazione primaria e secondaria del TCR. Inoltre abbiamo analizzato il signaling del CD4 e l'attivazione di Lck a seguito della stimolazione del CD4 di cellule T quiescenti infettate con HIV-1 wt o ΔΝef. I risultati mostrano che in linfociti T CD4+ quiescenti latentemente infettati, mentre i livelli basali del CD4 e di Lck sono ridotti dal Nef, il signaling del CD4 si mantiene inalterato. In seguito ad attivazione via CD3/CD28, in cellule T quiescenti si osserva l’induzione sia di molecole precoci effettrici fosforilate in Tirosina, sia della via di segnalazione di NF-kB. Questo fenomeno si verifica con le stesse cinetiche e agli stessi livelli sia in cellule non infettate che infettate con HIV-1 wt e ΔNef. Al contrario mediante attivazione secondaria via CD3/CD28 di linfociti T CD4+ quiescenti infettati con HIV-1 abbiamo osservato un ritardo nella fosforilazione di PLC-γ1 Nef-dipendente. Infine in cellule T attivate e infettate con HIV-1 sia la forte diminuzione del CD4 di superficie indotta da Nef e dalle proteine virali tardive (Env, Vpu) che la down-regolazione del CD28, possono avvenire a causa delle capacità del Nef di compromettere la formazione della sinapsi immunologica. Apparentemente Nef regola l'attivazione dipendentemente dall'ambiente cellulare, Nef: incrementa l'attivazione di cellule quiescenti allo scopo di favorire l'iniziale replicazione virale, mentre inibisce successivi cicli di stimolazione del TCR, probabilmente ai fini di evitare l'apoptosi che limiterebbe la replicazione virale. La futura identificazione di molecole target regolate dal Nef è di fondamentale importanza per comprendere come HIV-1 interferisca con la funzione della cellula T per facilitare il rilascio virale.