The development of an efficacious HIV vaccine is one of the world’s greatest public-health challenges. The poor understanding of immune correlates of protection and the widespread genetic diversity of the virus pose substantial scientific hurdles. HIV infection is a mucosal acquired disease. Therefore, mucosal immune responses might function as a first line of defense against viral infection, and the development of vaccines against HIV-1 able to elicit mucosal immunity is a high priority. In particular, immunization targeting local mucosal surfaces or the regional lymph nodes to elicit both humoral and cellular specific immune responses may present a strategy for preventing or controlling HIV-1 replication. A number of clinical and experimental observations suggest that CD8+ T cells play an important role in the containment of HIV-1 infection. These include evidence of the temporal association between the appearance of HIV-specific CD8+ T cell responses following acute infection and the reduction in viral replication to set-point, the significant association of particular MHC class I alleles with protection from HIV-1 disease progression, and the increase in viral replication following depletion of CD8+ cells in the macaque model of AIDS virus infection. Several vaccine strategies depend on prime-boost protocols that produce a selective increase of memory T cells specific for the HIV antigen carried by vectors. Among the different antigen delivery systems, live recombinant viral vectors have the capacity of inducing strong cellular immune responses and can also prime antibody responses against expressed foreign antigens. In particular, recombinant influenza viruses engineered to express HIV-1 antigens represent promising tools to elicit both mucosal and systemic immune responses against HIV-1. Therefore, we generated a recombinant Influenza A virus (WSN/CKG) expressing the peptide cluster PCLUS3, derived from the gp120 of HIV-1, the P18IIIB cytotoxic T-lymphocyte (CTL) epitope derived from the V3 loop of HIV-1 IIIB gp120, and a second CTL epitope derived from Gag of HIV-1, fused to the N-terminal end of mature HA of A/WSN/33 virus. Then, we determined the capacity of WSN/CKG virus to induce antigen-specific mucosal and systemic immune responses upon intranasal or vaginal infection of progesterone-treated mice, and to provide protection against challenge with recombinant Vaccinia viruses, expressing Env (vPE16) or Gag (vDK1) proteins from HIV-1. We observed that a single vaginal inoculation of mice with WSN/CKG virus elicited antigen-specific CD8+ T cells, in the spleen and iliac lymph nodes (ILNs) draining the genitorectal mucosa, that peaked around day 7 postinfection, and that were rapidly recalled in the spleen upon intraperitoneal challenge with the recombinant Vaccinia viruses vPE16 and vDK1. These results were similar to those observed in mice primed intranasally with WSN/CKG virus. We therefore measured V3 loop-specific antibodies in serum samples of mice at 1 month post single immunization with WSN/CKG virus, and we observed significant levels of P18IIIB-specific IgG in mice receiving virus either by vaginal or intranasal route. Finally, we provide evidence that immune responses induced by WSN/CKG virus in the mucosal and systemic lymphoid compartments result in protection against systemic vPE16 virus challenge. Overall, these results indicate that mucosal immunization and, in particular, local vaginal immunization with recombinant Influenza viruses can provide protective and durable specific immune responses in mice.

Lo sviluppo di un vaccino efficace contro il virus dell’HIV-1 è una delle più importanti sfide che la Sanità pubblica sta affrontando in questi ultimi 20 anni. Una conoscenza ancora incompleta dei correlati di protezione e la variabilità genetica del virus HIV pone sostanziali impedimenti al raggiungimento di questo obiettivo. L’infezione dal virus HIV-1 si acquisisce prevalentemente attraverso la mucosa del tratto genito-rettale, pertanto, l’induzione di un’immunità mucosale rappresenta uno degli obiettivi primari nelle strategie che mirano a definire un efficace vaccino per il virus HIV-1. In particolare, un’immunizzazione in grado di attivare una risposta sia cellulare che umorale nelle mucose coinvolte nei processi di acquisizione del virus o dei linfonodi regionali può rappresentare una strategia efficace di prevenzione o controllo della replicazione e diffusione del virus dal sito di ingresso, ai tessuti linfoidi e al sangue. Numerose osservazioni suggeriscono il ruolo importante che i linfociti T CD8+ svolgono nel contenimento dell’infezione con il virus HIV-1, tra queste l’evidenza dell’associazione temporale tra la comparsa di una risposta mediata dai linfociti T HIV-specifici in seguito all’infezione acuta e la riduzione della replicazione virale ad un livello stabile (set-point), l’associazione significativa di particolari alleli MHC I con la protezione dalla progressione della malattia, e l’aumento della replicazione virale in seguito alla deplezione dei linfociti T CD8+ in modelli di studio macachi/HIV-1. Diverse strategie vaccinali nei confronti del virus HIV-1 si basano sull’impiego di protocolli di “prime-boost” in grado di indurre un aumento selettivo di linfociti T della memoria specifici per antigeni del virus HIV trasportati da vettori. Tra i diversi sistemi di trasporto e rilascio di antigeni, i vettori virali vivi ricombinanti sono ampiamente considerati, poiché hanno la capacità di attivare una forte risposta cellulare ed anticorpale nei confronti degli antigeni che esprimono. Il virus influenzale ricombinante, che esprime antigeni estranei provenienti dal virus HIV-1, è uno strumento promettente in tal senso. Alla luce di tali premesse abbiamo ritenuto interessante valutare la capacità di un virus influenzale di tipo A che esprime un poliepitopo HIV fuso all’estremità N-terminale della emagglutinina (HA) matura, di indurre una risposta immunitaria cellulare e umorale in seguito all’infezione di topi BALB/c per via vaginale e di conferire protezione nei confronti di un’infezione secondaria con i virus Vaccinia ricombinanti che esprimono gli stessi antigeni. In particolare abbiamo generato un virus influenzale ricombinante dal fenotipo attenuato (WSN/CKG), che esprime il peptide cluster PCLUS3, derivato dalla glicoproteina gp120 di HIV-1, il peptide P18IIIB, epitopo per i linfociti T citotossici (CTL) derivato dal loop V3 della gp120 di HIV-1 IIIB, e un secondo epitopo CTL derivato dalla proteina Gag di HIV-1, nella regione N-terminale del virus A/WSN/CKG. Mediante saggi ELISPOT, abbiamo osservato che una singola somministrazione per via vaginale con il virus WSN/CKG, induce nei topi una risposta immune a lungo termine mediata da linfociti T CD8+ antigene-specifici, nei linfonodi iliaci (ILN) drenanti la mucosa genito-rettale, e nella milza dei topi infettati, con un picco intorno al settimo giorno dopo l’infezione, che viene rapidamente richiamata nella milza in seguito ad un’infezione secondaria con il virus Vaccinia esprimente la proteina Env (vPE16) o Gag (vDK1). Tali risultati sono analoghi se i topi vengono immunizzati per via intranasale. Abbiamo poi analizzato mediante saggi ELISA la produzione di anticorpi antigene-specifici nel siero di topi ad un mese dall’infezione con il virus WSN/CKG e abbiamo osservato elevati livelli di IgG P18IIIB-specifiche nei topi che sono stati infettati sia per via intranasale che vaginale. L’immunità indotta attraverso l’infezione con il virus WSN/CKG è, inoltre, in grado di conferire protezione ai topi contro un’infezione secondaria con il virus Vaccinia ricombinante vPE16. I dati che abbiamo ottenuto complessivamente dal nostro studio indicano che un’immunizzazione mucosale, ed in particolare, un’immunizzazione per via vaginale, con un virus influenzale ricombinante che esprime un poliepitopo derivante dal virus HIV-1 può indurre nei topi una risposta immunitaria antigene-specifica, protettiva e a lungo termine.

Stillitano, M.G. (2009). Vettori virali influenzali contenenti determinanti antigenici di HIV-1 inducono immunità protettiva nei topi dopo singola immunizzazione per via mucosale.

Vettori virali influenzali contenenti determinanti antigenici di HIV-1 inducono immunità protettiva nei topi dopo singola immunizzazione per via mucosale

STILLITANO, MARIA GIUSEPPINA
2009-09-03

Abstract

Lo sviluppo di un vaccino efficace contro il virus dell’HIV-1 è una delle più importanti sfide che la Sanità pubblica sta affrontando in questi ultimi 20 anni. Una conoscenza ancora incompleta dei correlati di protezione e la variabilità genetica del virus HIV pone sostanziali impedimenti al raggiungimento di questo obiettivo. L’infezione dal virus HIV-1 si acquisisce prevalentemente attraverso la mucosa del tratto genito-rettale, pertanto, l’induzione di un’immunità mucosale rappresenta uno degli obiettivi primari nelle strategie che mirano a definire un efficace vaccino per il virus HIV-1. In particolare, un’immunizzazione in grado di attivare una risposta sia cellulare che umorale nelle mucose coinvolte nei processi di acquisizione del virus o dei linfonodi regionali può rappresentare una strategia efficace di prevenzione o controllo della replicazione e diffusione del virus dal sito di ingresso, ai tessuti linfoidi e al sangue. Numerose osservazioni suggeriscono il ruolo importante che i linfociti T CD8+ svolgono nel contenimento dell’infezione con il virus HIV-1, tra queste l’evidenza dell’associazione temporale tra la comparsa di una risposta mediata dai linfociti T HIV-specifici in seguito all’infezione acuta e la riduzione della replicazione virale ad un livello stabile (set-point), l’associazione significativa di particolari alleli MHC I con la protezione dalla progressione della malattia, e l’aumento della replicazione virale in seguito alla deplezione dei linfociti T CD8+ in modelli di studio macachi/HIV-1. Diverse strategie vaccinali nei confronti del virus HIV-1 si basano sull’impiego di protocolli di “prime-boost” in grado di indurre un aumento selettivo di linfociti T della memoria specifici per antigeni del virus HIV trasportati da vettori. Tra i diversi sistemi di trasporto e rilascio di antigeni, i vettori virali vivi ricombinanti sono ampiamente considerati, poiché hanno la capacità di attivare una forte risposta cellulare ed anticorpale nei confronti degli antigeni che esprimono. Il virus influenzale ricombinante, che esprime antigeni estranei provenienti dal virus HIV-1, è uno strumento promettente in tal senso. Alla luce di tali premesse abbiamo ritenuto interessante valutare la capacità di un virus influenzale di tipo A che esprime un poliepitopo HIV fuso all’estremità N-terminale della emagglutinina (HA) matura, di indurre una risposta immunitaria cellulare e umorale in seguito all’infezione di topi BALB/c per via vaginale e di conferire protezione nei confronti di un’infezione secondaria con i virus Vaccinia ricombinanti che esprimono gli stessi antigeni. In particolare abbiamo generato un virus influenzale ricombinante dal fenotipo attenuato (WSN/CKG), che esprime il peptide cluster PCLUS3, derivato dalla glicoproteina gp120 di HIV-1, il peptide P18IIIB, epitopo per i linfociti T citotossici (CTL) derivato dal loop V3 della gp120 di HIV-1 IIIB, e un secondo epitopo CTL derivato dalla proteina Gag di HIV-1, nella regione N-terminale del virus A/WSN/CKG. Mediante saggi ELISPOT, abbiamo osservato che una singola somministrazione per via vaginale con il virus WSN/CKG, induce nei topi una risposta immune a lungo termine mediata da linfociti T CD8+ antigene-specifici, nei linfonodi iliaci (ILN) drenanti la mucosa genito-rettale, e nella milza dei topi infettati, con un picco intorno al settimo giorno dopo l’infezione, che viene rapidamente richiamata nella milza in seguito ad un’infezione secondaria con il virus Vaccinia esprimente la proteina Env (vPE16) o Gag (vDK1). Tali risultati sono analoghi se i topi vengono immunizzati per via intranasale. Abbiamo poi analizzato mediante saggi ELISA la produzione di anticorpi antigene-specifici nel siero di topi ad un mese dall’infezione con il virus WSN/CKG e abbiamo osservato elevati livelli di IgG P18IIIB-specifiche nei topi che sono stati infettati sia per via intranasale che vaginale. L’immunità indotta attraverso l’infezione con il virus WSN/CKG è, inoltre, in grado di conferire protezione ai topi contro un’infezione secondaria con il virus Vaccinia ricombinante vPE16. I dati che abbiamo ottenuto complessivamente dal nostro studio indicano che un’immunizzazione mucosale, ed in particolare, un’immunizzazione per via vaginale, con un virus influenzale ricombinante che esprime un poliepitopo derivante dal virus HIV-1 può indurre nei topi una risposta immunitaria antigene-specifica, protettiva e a lungo termine.
A.A. 2008/2009
Microbiologia medica e immunologia
21.
The development of an efficacious HIV vaccine is one of the world’s greatest public-health challenges. The poor understanding of immune correlates of protection and the widespread genetic diversity of the virus pose substantial scientific hurdles. HIV infection is a mucosal acquired disease. Therefore, mucosal immune responses might function as a first line of defense against viral infection, and the development of vaccines against HIV-1 able to elicit mucosal immunity is a high priority. In particular, immunization targeting local mucosal surfaces or the regional lymph nodes to elicit both humoral and cellular specific immune responses may present a strategy for preventing or controlling HIV-1 replication. A number of clinical and experimental observations suggest that CD8+ T cells play an important role in the containment of HIV-1 infection. These include evidence of the temporal association between the appearance of HIV-specific CD8+ T cell responses following acute infection and the reduction in viral replication to set-point, the significant association of particular MHC class I alleles with protection from HIV-1 disease progression, and the increase in viral replication following depletion of CD8+ cells in the macaque model of AIDS virus infection. Several vaccine strategies depend on prime-boost protocols that produce a selective increase of memory T cells specific for the HIV antigen carried by vectors. Among the different antigen delivery systems, live recombinant viral vectors have the capacity of inducing strong cellular immune responses and can also prime antibody responses against expressed foreign antigens. In particular, recombinant influenza viruses engineered to express HIV-1 antigens represent promising tools to elicit both mucosal and systemic immune responses against HIV-1. Therefore, we generated a recombinant Influenza A virus (WSN/CKG) expressing the peptide cluster PCLUS3, derived from the gp120 of HIV-1, the P18IIIB cytotoxic T-lymphocyte (CTL) epitope derived from the V3 loop of HIV-1 IIIB gp120, and a second CTL epitope derived from Gag of HIV-1, fused to the N-terminal end of mature HA of A/WSN/33 virus. Then, we determined the capacity of WSN/CKG virus to induce antigen-specific mucosal and systemic immune responses upon intranasal or vaginal infection of progesterone-treated mice, and to provide protection against challenge with recombinant Vaccinia viruses, expressing Env (vPE16) or Gag (vDK1) proteins from HIV-1. We observed that a single vaginal inoculation of mice with WSN/CKG virus elicited antigen-specific CD8+ T cells, in the spleen and iliac lymph nodes (ILNs) draining the genitorectal mucosa, that peaked around day 7 postinfection, and that were rapidly recalled in the spleen upon intraperitoneal challenge with the recombinant Vaccinia viruses vPE16 and vDK1. These results were similar to those observed in mice primed intranasally with WSN/CKG virus. We therefore measured V3 loop-specific antibodies in serum samples of mice at 1 month post single immunization with WSN/CKG virus, and we observed significant levels of P18IIIB-specific IgG in mice receiving virus either by vaginal or intranasal route. Finally, we provide evidence that immune responses induced by WSN/CKG virus in the mucosal and systemic lymphoid compartments result in protection against systemic vPE16 virus challenge. Overall, these results indicate that mucosal immunization and, in particular, local vaginal immunization with recombinant Influenza viruses can provide protective and durable specific immune responses in mice.
vettori virali influenzali; immunizzazione vaginale; HIV-1; linfociti T CD8 HIV-specifici; immunità mucosale protettiva
Settore MED/07 - Microbiologia e Microbiologia Clinica
Italian
Tesi di dottorato
Stillitano, M.G. (2009). Vettori virali influenzali contenenti determinanti antigenici di HIV-1 inducono immunità protettiva nei topi dopo singola immunizzazione per via mucosale.
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