La multiresistenza in Salmonella: caratterizzazione molecolare di un nuovo clone emergente di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium

Salmonella enterica serovar Typhimurium (STM) represents the prevalent cause of foodborne gastroenteritis in Italy with the majority of isolates exhibiting multidrug resistance, mainly to ampicillin (A), chloramphenicol (C), streptomycin (S), sulfonamide (Su) and tetracycline (T) (ACSSuT). However, a new resistance pattern (R-type) ASSuT, lacking resistance to C, has recently emerged in Italy among strains of STM and of its monophasic variant, Salmonella enterica subspecie enterica serovar S. 4,[5],12:i:– . The main objective of this thesis has been the characterization of STM and S. 4,[5],12:i:– strains with R-type ASSuT, using both molecular and phenotypic typing technique, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and phage typing, in order to evaluate their clonal origin and the relationships with the ACSSuT strains. In addition, by the use of the Pulse-Net database it was evaluated if ASSuT strains were present in other European countries in order to set up an international collection of these strains. This collection has been further characterized with the identification of resistance genes, the investigation of their localization, and determination of the resistance region. Among both the STM and S. 4,[5],12:i:– ASSuT strains, the predominant PFGE profile was STYMXB.0079, while the STM ACSSuT strains belonged to the STYMXB.0061 and STYMXB. 0067. Bionumerics cluster analysis of PFGE profiles showed that more than 90% of ASSuT and ACSSuT resistant strains were included in two distinct clusters with a genetic homology of 73% each other, suggesting that the ASSuT resistant strains belong to a same clonal lineage different from that of the ACSSuT strains. Phage typing showed that both STM and S. 4,[5],12:i:– ASSuT strains were not typeable (DTNT) or U302. A different figure was observed for the ACSSuT strains: the STM strains mostly belonged to DT104. The Pulse-Net Europe database, allowed us to identify ASSuT strains, both STM and S. enterica 4,[5],12:i:–, isolated in Denmark and UK, with the same or very closely related PFGE patterns as the Italian strains, suggesting that the ASSuT clone is circulating in different European countries. The resistance genes were identified in 64 strains of STM and S. enterica 4,[5],12:i:–with ASSuT R-type and in 11 STM strains with different resistance patterns and PFGE profiles as controls. All strains were isolated from human infections in Italy, Denmark and UK. All the ASSuT strains were positive for the following resistance genes: blaTEM, strA-strB, sul2 and tet(B). The control strains showed the same gene pattern, in accordance with their resistance profiles. A variability of the genes conferring resistance to tetracycline was detected. Localization experiments demonstrated that the ASSuT resistance genes are chromosomally located. Finally, the complete sequence of ASSuT resistance cluster was determined. This cluster is composed by two resistance island (RI1 and RI2) divided by chromosomal DNA. In particular, RI1 is comprised between two IS26 and contains deltatnp3R, blaTEM-1, tnpB , followed by strB, strA, sul2, repC, DeltarepA and another IS26. RI2 is bracketed by two IS26, comprising deltaIS10L, tetracycline resistance gene, IS1, the operon for resistance to mercury, yaeA gene, and a putative transposase (tniAdelta). Both this RIs show 99% sequence identity to two adiacent region of pHCM1 plasmid, harbored in S. Typhi isolated in Vietnam. IS26 elements could have played a role in the assembly of this resistance cluster but it will be investigated more in detail. In conclusion the work of this thesis indicates that the tetra-resistant ASSuT strains of STM and S. 4,[5],12:i:–, increasingly isolated in Italy, belong to a same clonal lineage and that the S. 4,[5],12:i:– strains circulating in our country, mainly derive from this STM clonal lineage. ASSuT clone is also circulating in Denmark and United Kingdom. The antimicrobial resistance pattern conferred by a chromosomal island, with an organization similar to previously reported clusters, deserves concern since the resistance could be stably maintained even in the absence of selective pressure.

Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (STM) rappresenta la prevalente causa di gastroenterite trasmessa da alimenti in Italia, con la maggior parte degli isolati con resistenza multipla agli antibiotici, principalmente ad ampicillina (A), cloramfenicolo (C), streptomicina (S), sulfamidici (Su) e tetraciclina (T) (ACSSuT). Un nuovo pattern di resistenza (R-type) ASSuT, mancante della resistenza a C, è recentemente emerso in Italia tra ceppi di STM e della sua variante monofasica, Salmonella enterica subspecie enterica sierotipo S. 4,[5],12:i:– . L’obiettivo principale di questa tesi è stato la caratterizzazione di ceppi di STM e di S. 4,[5],12:i:– con R-type ASSuT, usando tecniche di tipizzazione molecolari e fenotipiche, quali l’elettroforesi in campo pulsato (PFGE) e la fagotipizzazione, allo scopo di valutare la loro origine clonale e la loro relazione con i ceppi ACSSuT. Usando il database Pulse-Net Europe è stata valutata la presenza di ceppi ASSuT in altre nazioni Europee al fine di allestire una collezione internazionale di ceppi. Questa collezione è stata ulteriormente caratterizzata, identificando i geni di resistenza, investigando la loro localizzazione, e determinando la regione di resistenza. Sia tra ceppi di STM che di S. 4,[5],12:i:–, il principale profilo di PFGE è rappresentato da STYMXB.0079, mentre i ceppi STM ACSSuT appartengono ai profili STYMXB.0061 e STYMXB.0067. L’analisi dei profili di PFGE con il software Bionumerics ha mostrato che più del 90% dei ceppi ASSuT e ACSSuT appartenevano a due distinti clusters con un’omologia genetica del 73%, dati che dimostrano l’appartenenza dei ceppi ASSuT ad un'unica linea clonale differente da quella dei ceppi ACSSuT. La maggior parte dei ceppi con profilo ASSuT non erano tipizzabili (DTNT) attraverso la fagotipizzazione o appartenevano al fagotipo U302. Al contrario i ceppi ACSSuT appartenevano principalmente al fagotipo DT104. Successivamente, nel database Pulse-Net Europe, è stato possibile identificare ceppi ASSuT, sia STM che S. 4,[5],12:i:– isolati in Danimarca ed Inghilterra, con profili di PFGE identici o strettamente correlati a quelli dei ceppi italiani, dati che indicano che il clone ASSuT è presente anche in altri paesi Europei. Al fine di identificare i geni responsabili della resistenza sono stati selezionati 64 ceppi di STM e S. 4,[5],12:i:– ASSuT, e 11 ceppi di STM con differenti R-type e profili di PFGE, usati come controlli. Tutti i ceppi provenivano da infezioni umane ed erano stati isolati in Italia, Danimarca e Inghilterra. Tutti i ceppi ASSuT erano positivi per i seguenti geni di resistenza: blaTEM, strA-strB, sul2 and tet(B). Successivi esperimenti di localizzazione hanno dimostrato che i geni di resistenza ASSuT sono localizzati sul cromosoma Infine, è stata determinata la sequenza completa del cluster di resistenza ASSuT. Questo cluster è composto da due isole di resistenza (RI1 e RI2) separate da DNA cromosomale. In particolare, RI1 è compresa tra due IS26 e contiene deltatnp3R, blaTEM-1, tnpB, seguito da strB, strA, sul2, repC, deltarepA ed un’atra IS26. RI2 è anch’essa compresa tra due IS26, comprendenti deltaIS10L, il gene di resistenza alla tetraciclina, IS1, l’operone per la resistenza al mercurio, il gene yaeA, e un’ ipotetica transposasi (tniAdelta). Entrambe le RIs mostrano il 99% di identità con due regioni adiacenti del plasmide pHCM1, presente nel ceppo di S. Typhi isolato in Vietnam. Le sequenze di inserzione IS26 potrebbero aver avuto un ruolo nella formazione di questo cluster di resistenza, ma quest’ipotesi deve essere ancora verificata. In conclusione il lavoro di questa tesi indica che i ceppi ASSuT di STM e S. 4,[5],12:i:–, in aumento in Italia, appartengono ad un'unica linea clonale e che i ceppi S. 4,[5],12:i:– circolanti nella nostra nazione, derivano principalmente da questa linea clonale di STM. Inoltre il clone ASSuT è diffuso anche in Danimarca ed Inghilterra. Il pattern di antibiotico resistenza conferito da un’isola di resistenza cromosomale, con un’organizzazione simile ad altri cluster precedentemente descritti, suscita preoccupazione poichè la resistenza può essere mantenuta stabilmente in assenza di pressione selettiva.