Effects of cholera toxin on cells of immune system

In this study, we analysed the effects of Cholera Toxin (CT) on cells of immune system. In particular, the mechanisms underling the inhibition of T cell proliferation mediated by CT on human CD4+ and CD8+ T lymphocytes were analysed. We observed that CT prevents the early activation steps of T lymphocytes and that these effects involve the modulation of costimulatory molecules CTLA-4 and CD28. We observed that CT up-regulates the expression of the inhibitory molecule CTLA-4 in resting CD4+ and CD8+ T lymphocytes. The regulation of CTLA-4 expression by CT is at the transcriptional level. Indeed, in cells treated with CT we observed an increase of two mRNA variants coding for the membrane and the soluble CTLA-4 molecules. In parallel with the up-regulation of the inhibitory molecule CTLA-4, CT down-modulates the costimulatory molecule CD28 on CD4+ and CD8+ resting T cells. The increased expression of CTLA-4 plays a role in controlling T cell activation and function as blocking anti-CTLA-4 F(ab’)2 mAbs partially prevents the inhibition mediated by CT. We evaluated the function of CT-pre-treated CD4+ T lymphocytes and we observed that they are able to inhibit the proliferation of autologous T lymphocytes stimulated with anti-CD3 mAbs. It is interesting that this phenomenon is, at least in part, a result of the release of extracellular cAMP. Therefore, by analysing the direct effects exerted by extracellular cAMP as a primary messenger on different cell types, we found that extracellular cAMP inhibits T cell proliferation and that it is able to interfere with the differentiation of monocytes into DCs. Monocytes induced to differentiated into DCs in the presence of extracellular cAMP, do not express CD1a molecules and retain the expression of CD14 acquiring a macrophages-like phenotype. Furthermore, they strongly up-regulate MHC class I and class II and CD86 costimulatory molecules giving rise to an activated population able to stimulate allogeneic T cell response. In addition, they produce a distinct pattern of cytokines upon maturation stimuli, they are unable to produce TNFα and IL-12 and they release high amount of IL-6 and IL-10. Furthermore, monocytes differentiated in the presence of cAMP show a reduced capacity of inducing the differentiation of IFNγ producing CD4+ T lymphocytes. Finally, the mechanisms through which extracellular cAMP can be sensed by the cells were studied. By using different adenosine receptors antagonists, we found that an extracellular cAMP-adenosine pathway is involved in the effects mediated by exogenous cAMP, suggesting that extracellular cAMP acting as primary messenger can be sensed by the cells of immune system and can modulate their functions.

In questa tesi sono stati analizzati gli effetti della Tossina Colerica (CT) sulle cellule del sistema immunitario. In particolare, sono stati studiati i meccanismi di inibizione della proliferazione dei linfociti T CD4+ e CD8+ umani da parte della CT. E’ stato osservato che la CT è in grado di prevenire l’attivazione dei linfociti T nelle fasi precoci e tale inibizione coinvolge la modulazione dell’espressione delle molecole CTLA-4 e CD28. E’ stato osservato che la CT up-regola l’espressione delle molecole inibitorie CTLA-4 e down-modula le molecole costimolatorie CD28 sui linfociti T CD4+ e CD8+ resting. L’incremento dell’espressione delle molecole CTLA-4 da parte della CT gioca un ruolo nel controllare l’attivazione e la proliferazione dei linfociti T, infatti, abbiamo osservato che anticorpi bloccanti anti-CTLA-4 F(ab’)2 sono in grado di prevenire, anche se parzialmente, tale inibizione. I nostri studi hanno valutato, inoltre, la funzione di linfociti T pre-trattati con la CT e abbiamo osservato che essi sono in grado di inibire la proliferazione di linfociti T autologhi stimolati con anti-CD3. Abbiamo inoltre osservato che questo fenomeno è mediato dal rilascio di cAMP all’esterno delle cellule. Alla luce di questi risultati, abbiamo analizzato gli effetti esercitati dall’cAMP extracellulare come primo messaggero su diversi tipi cellulari. L’cAMP extracellulare è in grado di inibire la proliferazione dei linfociti T ed è in grado di interferire con il differenziamento dei monociti in cellule dendritiche (DCs). Infatti, monociti differenziati in presenza di cAMP esogeno, non esprimono molecole CD1a e mantengono l’espressione di molecole CD14, acquisendo un fenotipo simile ai macrofagi. Tuttavia, le cellule generate in presenza di cAMP esogeno esprimono alti livelli di molecole MHC di classe II e di classe I e molecole costimolatorie CD86, mostrando un fenotipo attivato in grado di stimolare risposte T allogeniche. Inoltre, tali cellule non sono in grado di produrre TNF-α e IL-12, ma rilasciano quantità elevate di IL-6 e di IL-10. Monociti trattati con cAMP extracellulare hanno una capacità ridotta di indurre il differenziamento di linfociti T CD4+ che producono IFN-γ. Infine, è stato investigato il meccanismo attraverso il quale il cAMP extracellulare interagisce con le cellule. Utilizzando diversi antagonisti dei recettori dell’adenosina, abbiamo osservato che gli effetti mediati dal cAMP extracellulare possono essere prevenuti. Tali risultati suggeriscono che l’cAMP sia trasformato in adenosina e che tale molecola, attraverso l’interazione con i suoi recettori, sia responsabile degli effetti mediati dal cAMP esogeno.