Characterization of phospholipase D protein of chlamydophila pneumoniae and immunological response in patients with acute coronary syndromes

Chlamydophila pneumoniae is a Gram-negative obligate intracellular eubacteria, with a biphasic developmental cycle and two distinct morphological forms: the extracellular infectious elementary body and the intracellular replicating reticulate body. C. pneumoniae is an aetiological agent of respiratory infection also suspected to play an immuno-pathogenetic role in atherosclerosis by contributing to inflammation and plaque instability. Phospholipases D (PLDs) are enzyme involved in lipid metabolism and others events which can direct or indirect impact on virulence and inflammatory response. To better understand the role of C. pneumoniae PLD (CpPLD) in cell biology and during the infection, the Cppld gene was cloned and expressed in Escherichia coli and the recombinant protein rCpPLD was purified. This generated protein was highly immunogenic in mice and capable to elicit anti-CpPLD antibodies in the general population exposed to C. pneumoniae. In vitro experiments of gene transcription and expression in Hep-2 infected cells, showed that Cppld gene was expressed highly to early and late chlamydial development, and the CpPLD protein was localized at the periphery of inclusions at 72 h post infection. Enzymatic activity was also investigated. The rCpPLD was able to synthesize cardiolipin from 2 molecules of phosphatidyl-glycerol, demonstrating that the CpPLD was a cardiolipin sinthase enzyme. Furthermore, the purpose of this study was to evaluate the serological response to the rCpPLD in patients with acute coronary syndromes (ACS) and in healthy blood donors. All serum samples were screened by microimmunefluorescence (MIF). the positive samples were categorized as subjects with presumptive C. pneumoniae infection or past exposure (only specific IgG) and chronic infection (presence of specific IgG and IgA). MIF-negative sera showed antibodies against rCpPLD. In MIF-positive subjects antibodies against to rCpPLD were consistently found in sera of ACS patients with chronic infection. Additionally, it was recognized an immunodominant epitope in position 233-252 aa (P5) of the CpPLD protein which strongly reacted with ACS sera. The CpPLD protein and its P5 peptide could be plausible antigens for the diagnosis of C. pneumoniae chronic infections in ACS patients. These data suggest that rCpPLD may be a useful tool for future studies concerning the role that this enzyme plays in the pathology and immune response to C. pneumoniae infection.

Chlamydophila pneumoniae è un batterio Gram-negative ed intracellulare obbligato, con un ciclo di sviluppo bifasico, in quanto assume due diverse forme: la forma extracellulare infettiva chiamata corpo elementare e la forma intracellulare replicativa chiamata corpo reticolare. C. pneumoniae è l’agente eziologico delle infezioni respiratorie e sembra giocare un ruolo immuno-patogenico nell’aterosclerosi contribuendo all’infiammazione ed instabilità della placca. Le Fosfolipasi D (PLDs) sono enzimi coinvolti nel metabolismo lipidico ed in altri eventi che direttamente o indirettamente agiscono sulla virulenza e la risposta infiammatoria. Per capire meglio il ruolo della PLD di C. pneumoniae (CpPLD) nella biologia cellulare e durante l’infezione, il gene Cppld è stato clonato ed espresso in Escherichia coli e la proteina ricombinante rCpPLD è stata purificata. Questa proteina si è dimostrata molto immunogenica e capace di individuare anticorpi anti-CpPLD di una popolazione generale di soggetti esposti a C. pneumoniae. Esperimenti in vitro di trascrizione genica ed espressione in cellule Hep-2 infettate, ha dimostrato che il gene Cppld è molto espresso all’inizio e alla fine del ciclo di sviluppo della Chlamydia e che la proteina CpPLD è localizzata alla periferia del corpo d’inclusione a 72 ore dall’infezione. Della proteina CpPLD è stata studiata anche l’attività enzimatica. rCpPLD è stata in grado di sintetizzare cardiolipina da 2 molecole di fosfatidil glicerolo, dimostrando di essere un enzima cardiolipina sintetasi. Inoltre, lo scopo di questo studio è stato anche quello di valutare la risposta sierologica alla rCpPLD in pazienti con sindrome coronarica acuta (ACS) ed in sangue di donatori sani. Tutti i sieri esaminati sono stati analizzati per microimmunofluorescenza (MIF). I campioni positivi sono stati categorizzati come soggetti con presuntiva infezione da C. pneumoniae o passata esposizione (solo specifiche IgG) ed infezione cronica (presenza di specifiche IgG e IgA). Nessun siero MIF-negativo ha mostrato anticorpi contro rCpPLD. In soggetti MIF-positivi, anticorpi contro rCpPLD sono stati consistentemente trovati in sieri di pazienti affetti da ACS con un’infezione cronica. In più è stato individuato un epitopo immunodominante P5 (aa 233-252) della proteina CpPLD, il quale reagisce fortemente con sieri di soggetti con ACS. La CpPLD ed il peptide P5 potrebbero essere utilizzati come antigeni per la diagnosi di C. pneumoniae in pazienti ACS con infezione cronica. Questi dati suggeriscono che rCpPLD potrebbe essere utile per futuri studi in merito al ruolo che quest’enzima gioca nella patologia e nella risposta immunitaria all’infezione da C. pneumoniae.