Sistema in real-time PCR per la rilevazione rapida di patogeni invasivi

n the last years a notable increase of the mortality is verified because of the infectious illnesses. The most alarming datum is the increase of the mortality for setticemia that from 1980 to 1992 has been of the 83% (1). The increase of the infections of the blood is undoubtedly tied up to the increase of the manoeuvres that facilitate the penetration and the colonization of the infecting agent in the circulatory stream. Often, there is a trend in increase of the antibiotic resistance, in fact a lot of batteriemies are sustained by multiresistenti germs that complicates the therapeutic approach. The batteriemies are divided in primary and secondary. The epidemiology and the eziologia of the BSIs is changed because of the increasing number of patients that need cares in the unity of intensive therapy and with the evolution of the medical cares more and more. If up to 1970 the patogenis of great isolation in the blood were the Gram - negative ¬, beginning from the eighties the Gram-positive ones have become the patogenis to great prevalence. Among the Gram-negative ones, those to great prevalence are: Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Bacteroides fragilis and Clostridium perfringenses are the most common anaerobis, while among the micetis the kind predominates is Candida strain. Among the gram-positive ones a log patogeno that in the next years you/he/she could represent a real world emergency it is the Staphilococcus aureus resistant (MRSA) meticillino. The Staphilococcus aureus is a bacterium gram + a lot of patogeno for the man, that provokes infections in any anatomical district In the resolution of the infections of the blood is fundamental a precocious therapeutic approach and contemplated. This last him deep without doubt on a timely and accurate diagnosis of laboratory. If the traditional crop of the bacterias remains the "standard gold" diagnostic in terms of accuracy and completeness of information that it furnishes, nevertheless fault in terms of rapidity. Purpose of this thesis has been that to introduce the experience matured in the application of new methodic molecular (REAL Time PCR) in the precocious diagnosis of the BSIs. If in fact the times of bacterial identification of the positive emocoltures wander around the 24-48 hours, the purpose of this thesis has been that to experiment a new system for the survey and identification of the bacterial Dna, present in the bottles of emocoltura positive the purpose of this thesis has been that to experiment a new system for the survey and identification of the bacterial Dna, present in the bottles of positive emocoltura, in more timely way. It has been considered a region of the ribosomial Dna between the gene 16S and the gene 23 Ss, the so-called region ISR or ITS. This is because its high variability in the nucleotidic sequence among the various kinds and its short dimension renders it the ideal target for the application of an experimental protocol of bacterial identification, based on the application of Real Time PCR technique. Our purpose has been to qualitatively discriminate the different bacterial strains, that more frequently cause BSIs in our Policlinico. A second aspect that has been considered is to appraise the prevalence of Stafilococcus aureus resistant (MRSA) metcillino in our policlinico., an emergent patogeno, that can create particular problems in the empirical therapy of the sepsis today based on the employment of glicopeptidi. For this germ it has also been valued the sensibility to the vancomicina (VRSA, VISA, h-VISA) and the presence of the leucocidina Panteon valentine (PVL). 300 positive emocoltures have been analyzed coming from patient of the PTV. In total there have been isolated 12 bacterial kinds. The prevailing kinds have been: S.epidermidis (31%), S.aureus (20%), E.faecalis (14%), E. coli(14%), K.pneumoniae (9%), P.aeruginosa (4.40%), Efaecium (3%), A. baumannii (1.6%) and other germs (3%). The temperatures of melting of every bacterial kind were coincident or however contained in an interval considered important for the affiliation to the same kind (0,5 °Cs).For the evaluation of the meticillino resistance in Staphylococcus aureus 60 champions have been examined. Of these, around the 31% are results positive MRSA (12 strains). Of these MRSA positive champions 2 strains have shown some MICs (inhibiting least concentration) > = 2, so that hVISA to be considered h-VISA. VISA (MIC > = 4) and VRSA (MIC > = 8) have not been found. For these 2 champions it has been valued also the presence of the gene Van-A, possible inheritance acquired by the enterococchis, but the gene has not been found. Also the Leucocidina Panteon Valentine has been submitted to screening, but the presence of this protein has not been confirmed in the analized strains. Very probably this is due to the fact that the strains are predominantly hospital. However it confirms that in our hospital there has been no anybody exchange genico among the hospital and community strains of Staphilococcus aureus.

Negli ultimi anni si è verificato un notevole incremento della mortalità a causa delle malattie infettive. Il dato più allarmante è l'aumento della mortalità per setticemia che dal 1980 al 1992 è stato dell' 83% (1). L'aumento delle infezioni del sangue è legato indubbiamente all'aumento delle manovre che facilitano la penetrazione e la colonizzazione dell'agente infettante nel torrente circolatorio. Spesso, inoltrec’è un trend in aumento dell'antibiotico resistenza, infatti molte batteriemie sono sostenute da germi multiresistenti che complicano l'approccio terapeutico. Le batteriemie si suddividono in primarie e secondarie. L'epidemiologia e l'eziologia delle BSI è cambiata a causa del numero sempre più crescente di pazienti che necessitano di cure nella unità di terapia intensiva e con l'evoluzione delle cure mediche. Se fino al 1970 i patogeni di maggior isolamento nel sangue erano i Gram-¬negativi, a partire dagli anni ottanta i Gram-positivi sono diventati i patogeni a maggiore prevalenza. Tra i Gram-negativi, quelli a maggiore prevalenza sono: Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Bacteroides fragilis e Clostridium perfringens sono gli anaerobi più comuni, mentre tra i miceti predomina il genere Candida. Tra i gram-positivi un ceppo patogeno che nei prossimi anni potrebbe rappresentare un vera e propria emergenza mondiale è lo Staphilococcus aureus meticillino resistente (MRSA). Lo Staphilococcus aureus è un batterio gram + molto patogeno per l’uomo, che provoca infezioni in qualsiasi distretto anatomico Nella risoluzione delle infezioni del sangue è fondamentale un approccio terapeutico precoce e mirato. Quest'ultimo si fonda senza dubbio su una diagnosi di laboratorio tempestiva e accurata. Se la coltura dei batteri tradizionale rimane il "gold standard" diagnostico in termini di accuratezza e di completezza di informazioni che fornisce, tuttavia pecca in termini di rapidità. Scopo di questa tesi è stato quello di presentare l'esperienza maturata nell'applicazione di nuove metodiche molecolari (REAL TIME PCR) nella diagnosi precoce delle BSI. Se infatti i tempi di identificazione batterica delle emocolture positive si aggirano intorno alle 24-48 ore, lo scopo di questa tesi è stato quello di sperimentare un nuovo sistema per la rilevazione e identificazione del DNA batterico, presente nei flaconi di emocoltura positivi, in modo più tempestivo. È stata presa in considerazione una regione del DNA ribosomiale compresa tra il gene 16S e il gene 23 S, la cosiddetta regione ISR o ITS. Questo perché la sua alta variabilità nella sequenza nucleotidica tra le varie specie e la sua ridotta dimensione ne fanno il target ideale per l'applicazione di un protocollo sperimentale di identificazione batterica, basata sull'applicazione in tempo reale con successiva curva di melting dell'amplificato. Il nostro scopo è stato quello di discriminare qualitativamente i diversi ceppi batterici, che più frequentemente causano BSI nel nostro Policlinico. Un secondo aspetto che è stato preso in considerazione è quello di valutare la prevalenza di Stafilococcus aureus metcillino resistente (MRSA) nel nostro policlinico., un patogeno emergente, che può creare particolari problemi nella terapia empirica delle sepsi ad oggi basata sull’impiego di glicopeptidi. Per questo germe è anche stata valutata la sensibilità alla vancomicina (VRSA,VISA, h-VISA) è la presenza della leucocidina Panteon valentie (PVL). Sono stati analizzate 300 emocolture positive provenienti da pazienti del PTV. In totale sono state isolate 12 specie batteriche. Le specie prevalenti sono state: S.epidermidis (31%), S.aureus (20%), E.faecalis (14%), E.coli (14%), K.pneumoniae (9%), P.aeruginosa (4.40%), Efaecium (3%), A. baumannii (1.6 %) e altri germi (3%). Le temperature di melting di ciascuna specie batterica erano coincidenti o comunque contenute in un intervallo considerato importante per l'appartenenza alla stessa specie (0,5 °C). Per la valutazione della meticillino resistenza nello Stafilococco aureo sono stati esaminati 60 campioni. Di questi sono risultati MRSA positivi circa il 31% (12 ceppi). Di questi campioni MRSA positivi 2 ceppi hanno mostrato delle MIC (concentrazione minima inibente) >=2, così da essere considerati h-VISA . Non sono stati trovati VISA (MIC>=4) e VRSA (MIC>=8). Per questi 2 campioni è stata valutata anche la presenza del gene Van-A, possibile eredità acquisita dagli enterococchi, ma il gene non è stato trovato. Anche la Leucocidina Panteon Valentine è stata sottoposta a screening, ma non è stata confermata la presenza di questa proteina nei ceppi testati. Questo molto probabilmente è dovuto al fatto che i ceppi sono prevalentemente ospedalieri. Però conferma che nel nostro ospedale non c’è stato nessuno scambio genico tra i ceppi ospedalieri e comunitari di Staphilococcus aureus.