Sistema in real-time PCR per la rilevazione rapida di patogeni invasivi

Negli ultimi anni si è verificato un notevole incremento della mortalità a causa delle malattie infettive. Il dato più allarmante è l'aumento della mortalità per setticemia che dal 1980 al 1992 è stato dell' 83% (1). L'aumento delle infezioni del sangue è legato indubbiamente all'aumento delle manovre che facilitano la penetrazione e la colonizzazione dell'agente infettante nel torrente circolatorio. Spesso, inoltrec’è un trend in aumento dell'antibiotico resistenza, infatti molte batteriemie sono sostenute da germi multiresistenti che complicano l'approccio terapeutico. Le batteriemie si suddividono in primarie e secondarie. L'epidemiologia e l'eziologia delle BSI è cambiata a causa del numero sempre più crescente di pazienti che necessitano di cure nella unità di terapia intensiva e con l'evoluzione delle cure mediche. Se fino al 1970 i patogeni di maggior isolamento nel sangue erano i Gram-¬negativi, a partire dagli anni ottanta i Gram-positivi sono diventati i patogeni a maggiore prevalenza. Tra i Gram-negativi, quelli a maggiore prevalenza sono: Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Bacteroides fragilis e Clostridium perfringens sono gli anaerobi più comuni, mentre tra i miceti predomina il genere Candida. Tra i gram-positivi un ceppo patogeno che nei prossimi anni potrebbe rappresentare un vera e propria emergenza mondiale è lo Staphilococcus aureus meticillino resistente (MRSA). Lo Staphilococcus aureus è un batterio gram + molto patogeno per l’uomo, che provoca infezioni in qualsiasi distretto anatomico Nella risoluzione delle infezioni del sangue è fondamentale un approccio terapeutico precoce e mirato. Quest'ultimo si fonda senza dubbio su una diagnosi di laboratorio tempestiva e accurata. Se la coltura dei batteri tradizionale rimane il "gold standard" diagnostico in termini di accuratezza e di completezza di informazioni che fornisce, tuttavia pecca in termini di rapidità. Scopo di questa tesi è stato quello di presentare l'esperienza maturata nell'applicazione di nuove metodiche molecolari (REAL TIME PCR) nella diagnosi precoce delle BSI. Se infatti i tempi di identificazione batterica delle emocolture positive si aggirano intorno alle 24-48 ore, lo scopo di questa tesi è stato quello di sperimentare un nuovo sistema per la rilevazione e identificazione del DNA batterico, presente nei flaconi di emocoltura positivi, in modo più tempestivo. È stata presa in considerazione una regione del DNA ribosomiale compresa tra il gene 16S e il gene 23 S, la cosiddetta regione ISR o ITS. Questo perché la sua alta variabilità nella sequenza nucleotidica tra le varie specie e la sua ridotta dimensione ne fanno il target ideale per l'applicazione di un protocollo sperimentale di identificazione batterica, basata sull'applicazione in tempo reale con successiva curva di melting dell'amplificato. Il nostro scopo è stato quello di discriminare qualitativamente i diversi ceppi batterici, che più frequentemente causano BSI nel nostro Policlinico. Un secondo aspetto che è stato preso in considerazione è quello di valutare la prevalenza di Stafilococcus aureus metcillino resistente (MRSA) nel nostro policlinico., un patogeno emergente, che può creare particolari problemi nella terapia empirica delle sepsi ad oggi basata sull’impiego di glicopeptidi. Per questo germe è anche stata valutata la sensibilità alla vancomicina (VRSA,VISA, h-VISA) è la presenza della leucocidina Panteon valentie (PVL). Sono stati analizzate 300 emocolture positive provenienti da pazienti del PTV. In totale sono state isolate 12 specie batteriche. Le specie prevalenti sono state: S.epidermidis (31%), S.aureus (20%), E.faecalis (14%), E.coli (14%), K.pneumoniae (9%), P.aeruginosa (4.40%), Efaecium (3%), A. baumannii (1.6 %) e altri germi (3%). Le temperature di melting di ciascuna specie batterica erano coincidenti o comunque contenute in un intervallo considerato importante per l'appartenenza alla stessa specie (0,5 °C). Per la valutazione della meticillino resistenza nello Stafilococco aureo sono stati esaminati 60 campioni. Di questi sono risultati MRSA positivi circa il 31% (12 ceppi). Di questi campioni MRSA positivi 2 ceppi hanno mostrato delle MIC (concentrazione minima inibente) >=2, così da essere considerati h-VISA . Non sono stati trovati VISA (MIC>=4) e VRSA (MIC>=8). Per questi 2 campioni è stata valutata anche la presenza del gene Van-A, possibile eredità acquisita dagli enterococchi, ma il gene non è stato trovato. Anche la Leucocidina Panteon Valentine è stata sottoposta a screening, ma non è stata confermata la presenza di questa proteina nei ceppi testati. Questo molto probabilmente è dovuto al fatto che i ceppi sono prevalentemente ospedalieri. Però conferma che nel nostro ospedale non c’è stato nessuno scambio genico tra i ceppi ospedalieri e comunitari di Staphilococcus aureus.