Regolazione del fattore trascrizionale p73 da parte del complesso E3 ubiquitina ligasi CDL4a e della proteina N4BP1

p73 is a structural and functional homolog of the tumor suppressing transcriptional factor p53. p73 and p53 are modular proteins with a similar basic structure formed by a transactivation domain (TA) situated at N-terminus of the protein, a DNA binding domain (DBD) in the central part of the protein and an oligodimerization domain (OD) at C-terminus of the factor. The core DNA binding domain is the region which shares the highest homology between p73 and p53. Consequently p73 can bind to canonical p53 DNA-binding site and activate transcription from p53-responsive promoters, thus inducing cell cycle arrest and apoptosis. p73 activity is finely regulated by different post-translational modifications including phosphorylation, acetylation, sumoylation and ubiquitination. In this thesis we have focused our attention on the role of ubiquitin partners in the regulation of p73. Ubiquitination is a multi-step process which involves sequentially three different kind of enzyme: the E1-activating enzyme responsible for the activation of the ubiquitin through an ATP-dependent mechanism, the E2-coniugating enzyme which receives directly from the E1 the activated ubiquitin and the E3 ubiquitin ligase enzyme which physically binds specific substrates and transfers the activated ubiquitin from the E2 to the target proteins. So the specificity of the reaction of ubiquitination is conferred by the activity of the E3 ligase. The E3 ligase are divided into two major groups: the RING-finger ligase and the HECT ligase. The RING finger are also subdivided into two subgroups: the monomeric RING-ligase and the multimeric RING ligase. The HECT ligase are constituted by a C2 domain at N-terminus of the protein, which is a calcium-lipid domain responsible for the interaction with the membrane, different WW domains in the central part which serve for the binding of the different substrates and an HECT domain at the C-terminus involved in the recruitment of the E2 enzyme. Furthermore the HECT domain contains the Cys catalitical residue responsible for the binding with the activated ubiquitin. In our laboratory we previously identified Itch as the HECT-type E3 ubiquitin ligase of p73 responsible for the proteosomical-dependent degradation. Recently we identified the protein N4BP1, which is first identified as a novel substrate of the E3 HECT ligase Nedd4, as a new interactor of Itch. In the first part of the project we investigated the mechanism of action of N4BP1 and the physiological significance of its function. We found that N4BP1, as p73, binds to WW2 domain of Itch, a region involved in the interaction with its substrates. This suggest that N4BP1 could compete with Itch substrates for the binding to the ligase. By performing an in vitro binding assay, we indeed demonstrated that N4BP1 acts as a competitor of p73. As a consequence the overexpression of N4BP1 increases both the p73 half-life and the transcriptional activity. Conversely genetic and RNAi knockdown of N4BP1 diminish the steady-state protein levels of p73 and c-Jun, and significantly impair their transcriptional activity. These results demonstrate that N4BP1 functions as a negative regulator of Itch and this activity is reflected on stabilization of the cell death regulator p73. The second part of my project has been focused on the characterization of the significance of the interaction between p73 and CDL4a. CDL4a is a multimeric complex constituted by cul4a, ROC1 e DDB1. ROC1 is a RING-finger protein which recruits the E2 enzyme, cul4a interacts with ROC1 and acts as a scaffold protein orienting the E2 enzyme versus the different substrates. The substrates are recruited or directly by DDB1 or conversely the interaction could be mediated by a WD40 protein which binds DDB1. By GST pulldown assay in vitro and CO-IP experiments in vivo, we demonstrated that p73 binds to CDL4a through a direct interaction with DDB1. Moreover CDL4a mediates the multiubiquitilation of p73 on different residue of lysine. It’s well established that the multiubiquitination of a target protein, is not a signal for a proteosomical-dependent degradation. Therefore, we hypothesized that the multiubiquitilation of p73, CDL4a mediated, doesn’t effect its protein stability. To confirm this, we measured p73 protein levels in cells depleted for DDB1 or cul4a. We showed that genetic and RNAi knockdown of DDB1 or of Cul4a, obtained from different strategies, don’t exert any effect on stability of p73. In agreement with this datas p73 decay rate is not even affected by the overexpression of the different members of the CDL4a. Finally we demonstrated that CDL4a inhibits the transcriptional activity of p73. In particular RNA mediated silencing or genetic knockdown of the different members of CDL4a induce an activation of different target genes of p73. These results highlighted two different ubiquitin-mediated pathways which regulates p73 stability, function and activity. N4BP1 acts as an indirect positive regulator of p73 while CDL4a multiubiquitinates p73 and negatively regulates p73 trascriptional activity. Future studies will be necessary to understand the contribution of both CDL4a and N4BP1 in regulating cell cycle, apoptosis and cancer development.

Il fattore di trascrizione p73 appartiene alla famiglia di p53. Similmente a p53, p73 è costituito da un dominio di trans-attivazione (TA) posizionato all’estremità amino-terminale della proteina, da un dominio di legame al DNA (DBD) situato nella regione centrale e da un dominio di oligomeridizzazione (OD) sito all’estremità carbossi-terminale. La regione con la più elevata omologia tra p73 e p53 risulta essere il DBD, che evidenzia una percentuale del 63% di identità aminoacidica tra le due proteine. Questo dato sottolinea la capacità di p73 di poter interagire con gli stessi elementi responsivi (RE) di p53, situati nei promotori dei suoi geni bersaglio. In conseguenza di ciò p73 può transattivare numerosi geni comunemente indotti da p53 e coinvolti nella risposta apoptotica o nella regolazione del ciclo cellulare. L’espressione di p73, così come quella di p53, è regolata a livello traduzionale. In particolare p73 è bersaglio di numerose modificazioni traduzionali quali fosforilazione, acetilazione, sumoilazione e ubiquitinazione. In particolare in questo lavoro di tesi ci concentreremo sul ruolo dell’ubiquitinazione di p73 nella regolazione della sua attività biologica. L’ubiquitinazione è un processo che avviene in tre diverse fasi ciascuna catalizzata dall’azione di un diverso enzima: la prima fase è catalizzata dall’enzima E1 (enzima attivatore) ed è preposta all’attivazione dell’ubiquitina tramite un meccanismo dipendente dall’utilizzo di ATP. La seconda fase è invece catalizzata dall’enzima di coniugazione E2, in grado di ricevere l’ubiquitina precedentemente attivata e di trasferirla all’enzima E3 ubiquitina ligasi. Quest’ultimo enzima catalizza il trasferimento finale dell’ubiquitina attivata ai substrati della reazione. La specificità del processo di ubiquitinazione è conferita dall’azione dell’E3 ligasi. Questo enzima è infatti in grado di interagire con l’E2 e di reclutare i diversi substrati specifici. L’E3 ligasi sono divise in due famiglie principali: le E3 di tipo HECT e le E3 di tipo RING-finger. Quest’ultime sono a loro volta suddivise in RING-finger monomeriche e RING-finger multimeriche. Le HECT ligasi mostrano una struttura modulare comune costituita da tre domini funzionali. All’estremità N-terminale il dominio di legame al calcio (C2) è necessario per l’interazione alle membrane, mentre il legame ai diversi substrati della ligasi è mediato da diversi domini WW posizionati nella regione centrale. Infine il dominio HECT situato all’estremità C-terminale lega l’enzima E2 e contiene il residuo di cisteina catalitica che è responsabile del trasferimento dell’ubiquitina dall’E2 al substrato specifico. Nel nostro laboratorio abbiamo precedentemente dimostrato come Itch, una E3 ubiquitina ligasi di tipo HECT sia responsabile dell’ubiquitinazione di p73. In particolare, verificando la capacità di Itch di promuovere la poliubiquitinazione di p73 e la sua successiva degradazione ad opera del proteosoma. Recentemente, abbiamo identificato la proteina Nedd4 binding protein 4 (N4BP1), precedentemente dimostrata essere un substrato del prototipo delle HECT ligasi Nedd4, come nuovo interattore di Itch, in grado di regolarne negativamente la sua attività. Nella prima parte del mio lavoro di tesi ci siamo occupati di approfondire i meccanismi alla base dell’interazione tra N4BP1 e Itch e di evidenziarne il significato funzionale. N4BP1 interagisce con la regione centrale di Itch contenente i domini WW, in particolare con il secondo dominio WW (WW2). Tale dominio è comunemente utilizzato per il legame con i diversi substrati di Itch, ed infatti anche p73 interagisce con la medesima regione. Suggerendo che N4BP1 possa competere per il legame su Itch con i suoi substrati. Tramite esperimenti di legame in vitro abbiamo effettivamente dimostrato che N4BP1 e p73 competono per il legame allo stesso sito su Itch. Questo meccanismo di competizione si riflette con i dati fisiologici ottenuti che attestano un ruolo indiretto di N4BP1 nella regolazione della stabilità di p73 e dei suoi substrati. Esperimenti condotti in assenza di N4BP1, ottenuta mediante knock out genetico o attraverso silenziamento per RNAi, mostrano una forte diminuzione dei livelli proteici di p73 e dei vari substrati di Itch. Inoltre la capacità di p73 di transattivare i suoi geni bersaglio è fortemente ridotta in assenza di N4BP1. In maniera reciproca, l’overespressione di N4BP1 aumenta la vita media di p73 e dei substrati di Itch ed inoltre provoca un incremento dell’attività trascrizionale dei substrati di Itch: p73 e c-Jun. Questi risultati identificano N4BP1 come regolatore negativo di Itch, in grado di modulare la stabilità e la funzionalità di diversi substrati di Itch. La seconda parte del lavoro di tesi è stata finalizzata alla comprensione del significato funzionale e fisiologico del legame tra p73 e la ligasi E3 RING-finger CDL4a. CDL4a è un complesso multimerico costituito dalla proteina ROC1, contenente il dominio RING-finger e responsabile dell’interazione con l’E2, dalla proteina cul4a che funziona come un adattatore molecolare facilitando il trasferimento dell’ubiquitina dall’E2 ai vari substrati, e dal fattore DDB1 responsabile del reclutamento dei diversi substrati o tramite un’interazione diretta con questi ultimi o attraverso un legame con proteine contenenti il dominio WD40. Tramite esperimenti di legame in vitro e co-IP in vivo abbiamo dimostrato che p73 interagisce con CDL4a attraverso un legame diretto con DDB1. L’interazione tra p73 e la ligasi è fondamentale per l’ubiquitinazione di p73. Abbiamo infatti verificato che CDL4a è in grado di multiubiquitinare p73. Poiché dalla letteratura è noto che la reazione di multi-ubiquitinazione non regola la degradazione proteica proteosoma-dipendente, abbiamo monitorato i livelli proteici di p73 in cellule deplete per DDB1 e per la cul4a. L’ablazione dei componenti del complesso CDL4a ottenuta tramite RNAi o tramite delezione genetica, non determina alcuna variazione della stabilità di p73. Inoltre anche l’emivita di p73 non subisce alcuna modulazione in seguito ad overespressione dei componenti di CDL4a. Infine abbiamo dimostrato che la multiubiquitinazione di p73 CDL4a-dipendente inibisce l’attività trascrizionale di p73. Questo effetto è stato confermato dall’aumentata induzione dei messaggeri e delle proteine dei geni bersaglio di p73 in assenza di DDB1 o di cul4a. I risultati ottenuti mostrano due differenti meccanismi di regolazione di p73 entrambi mediati dalla reazione di ubiquitinazione. N4BP1 inibendo Itch, esercita indirettamente un ruolo di regolatore positivo nei confronti di p73, mentre CDL4a multiubiquitina p73 e ne regola negativamente l’attività trascrizionale. Studi futuri potrebbero essere indirizzati verso una migliore comprensione del ruolo svolto da entrambi N4BP1 e CDL4a nella regolazione del ciclo cellulare, nell’induzione apoptotica e nella progressione tumorale.