Significato clinico dell'espressione della proteina ZAP-70 nelle leucemie linfatiche croniche

Dysfunctional apoptosis and cell cycle are the main reasons for the clinical enigma, that CLL can not yet be cured with conventional chemotherapy. In B-CLL, malignant cells seem to be arrested in the G0/early G1 phase of the cell cycle, and inhibition of spontaneous apoptosis and upregulation of the anti-apoptotic protein bcl-2 define clinical prognosis. However, increasing evidence exists that disease progression relies upon cycling B-CLL cells: a proliferating pool of cells has been described in lymph nodes and bone marrow and might feed the accumulating pool in the blood. Moreover, the lack of immunoglobulin (Ig) VH gene mutation also has been shown to predict a rapid disease progression (DP) and an inferior overall survival (OS) (Damle, Hamblin, 1999). B-CLL cells that use non-mutated IgVH genes express ZAP-70 RNA, which encodes ZAP-70, a 70-kDa protein tyrosine kinase, associated both with an enhanced B cell receptor signaling and with an early DP risk in B-CLL (Del Principe, 2006). Moreover, the today availability of rapamycin or proteasome inhibitors effective against proliferating B-CLL cells and bcl-2 antisense oligonucleotides prompted us to evaluate the real impact of proliferation and apoptosis pathways on B-CLL prognosis. The primary aims of our study were: 1) to determine progression-free survival (PFS) upon apoptosis/proliferation subgroups and ZAP-70 expression; 2) whether apoptosis/proliferation could predict varied outcome within ZAP-70 subgroups; and finally 3) whether ZAP-70 and apoptosis/proliferation groups were independent prognostic factors. Therefore we investigated 265 pts, median age 64 years (range 37-84), 136 males and 129 females. With regard to modified Rai stages, 87 patients had a low stage, 170 an intermediate stage and 8 a high stage. ZAP-70 was quantified by a multicolor flow cytometric method fixing a cut-off value of 20%. Bcl-2 was determined by flow cytometry, dividing mean fluorescence intensity (MFI) of CD19+B-CLL cells / MFI of T-cells (Bcl-2B/T). The threshold was set at the median value >1.6. Transferrin receptor (CD71) was used as a measure of the proliferation and the threshold was set at the median value >8%. Combining Bcl-2B/T with CD71 (Bcl2CD71) we enucleated three subgroups: 1) Bcl2CD71- [106 pts] with low proliferation (CD71 <8%) and high apoptosis (Bcl-2B/T <1.6); 2) Bcl2CD71+ [49 pts] with high proliferation (CD71>8%) and low apoptosis (Bcl-2B/T >1.6); and 3) Bcl2CD71+/- [110 pts] with low proliferation and low apoptosis or with high proliferation and high apoptosis. ZAP-70+ B-CLL patients were 95/265 (36%). In 111 studied pts ZAP-70 expression and Ig V gene mutational status were significantly correlated (p<0.00001). Furthermore, we found significant associations either between lower ZAP-70 and lower Bcl-2B/T index (p=0.001) or lower ZAP-70 and Bcl2CD71- (p=0.002), confirming that low levels of ZAP-70 were characterized by high apoptosis and low proliferation. With regard to clinical outcome, a significant shorter progression-free survival (PFS) was observed in ZAP-70+ pts vs ZAP-70 negative pts (0% vs 58% at 13 years; p<0.00001) and in Bcl2CD71+ pts vs Bcl2CD71- pts (10% vs 56% at 12 years; p<0.00001). The Bcl2CD71+/- subgroup showed an intermediate outcome (30% at 12 years). To further explore the prognostic impact of Bcl2CD71 index, we investigated its expression within ZAP70+ (95 pts) and ZAP70- (170 pts) subsets. As a matter of fact, Bcl2CD71 was not able to identify prognostic subsets within ZAP-70+ pts, because all these cases presented a shorter PFS without significant differences. On the other hand, this index identified subsets at different PFS within the ZAP-70 negative subgroup (73% for Bcl2CD71- pts vs 29% for Bcl2CD71+ at 12 years, p=0.00009). In multivariate analysis of PFS, in which age, Rai modified stages, CD38, soluble CD23 (sCD23), lymphocyte doubling time (LDT), Bcl-2CD71 and ZAP-70 entered, ZAP-70 (p=0.00005), LDT (p=0.006), Rai modified stages (p=0.03) and sCD23 (p=0.01) resulted to be independent prognostic factors. Therefore, ZAP-70 was confirmed as the most important indipendent prognostic factor with regard to PFS. However, our apoptotic/proliferative index (Bcl2CD71), performed by flow cytometry, was very useful to identify pts at different progression rate within the ZAP-70 negative subgroup. Since the ZAP-70 negative subset represents a large and heterogeneous B-CLL population with a variable progression, other biological factors, such as the amount of apoptosis and the proliferative rate, have to be added in order both to identify early progressive pts and to take timely accurate therapeutic decisions.

L’apoptosi e il ciclo cellulare privi di normali controlli sono i principali motivi che determinano la mancata risposta dell’LLC nei confronti della chemioterapia convenzionale. Nella LLC-B sembra che il ciclo cellulare sia arrestato alla fase G0/G1, l’inibizione della spontanea apoptosi e l’up-regolazione dell’espressione della proteina anti-apoptotica bcl-2 definisce la prognosi clinica. Comunque, esistono delle evidenze che la progressione della malattia è correlate con il ciclo cellulare delle cellule nella LLC-B: un pool di cellule proliferanti è stato riscontrato nei linfonodi e nel midollo osseo e potrebbe rifornire il pool di cellule in accumulo nel sangue periferico. Inoltre, la presenza di mutazioni nel gene che codifica per le catene leggere delle immunoglobuline (Ig) VH si correla con una rapida progressione di malattia (DP) ed una ridotta sopravvivenza (OS) (Damle, Hamblin, 1999). Le cellule B di pazienti affetti da LLC che presentano geni IgVH non mutati esprimono l’RNA ZAP 70 che codifica per la proteina ZAP-70, una proteina tirosin chinasi di 70-kDa, che ha proprietà di molecola segnale, associata ad un incremento delle cellule B e ad un aumento del rischio di progressione della malattia nella LLC-B. (Del Principe, 2006). Inoltre, ad oggi la disponibilità di rinfamicina o inibitori dei proteosomi contro la proliferazione di cellule B nella LLC e l’uso di oligonucleotidi antisenso bcl-2 ci ha suggerito di valutare il reale impatto del meccanismo dell’apoptosi e della proliferazione sulla prognosi della LLC-B. I principali scopi del nostro studio sono stati: 1) determinare la sopravvivenza libera da progressione (PFS) rispetto all’apoptosi/proliferazione e all’espressione di ZAP-70; 2) se l’apoptosi/proliferazione potrebbe predire percorsi alternativi all’interno del gruppo che presenta ZAP-70; e infine 3) se ZAP-70 e il gruppo apoptosi/proliferazione erano indipendenti da fattori prognostici. Perciò noi abbiamo analizzato 265 pazienti, età mediana di 64 anni (range 37-84), 136 maschi e 129 femmine. In riferimento alla stadio Rai modificato, 87 pazienti avevano un basso stadio, 170 uno stadio intermedio e 8 un alto stadio. ZAP-70 fu quantificato mediante citometria a flusso multicolour utilizzando il metodo di fissaggio e permeabilizzazione ritenendo significativo un valore superiore al 20%. Anche Bcl-2 fu determinata attraverso la citometria a flusso, dividendo per la media dell’intensità di fluorescenza (MFI) delle cellule CD19+B-CLL / MFI delle cellule T (Bcl-2B/T). La threshold fu settata ad un valore mediano >1.6. Il recettore per la Transferrina (CD71) fu utilizzato come stima della proliferazione e la threshold fu settata ad un valore mediano >8%. Combinando Bcl-2B/T con CD71 (Bcl2CD71) sono stati ottenuti tre sottogruppi: 1) Bcl2CD71- [106 pts] con basso livello di proliferazione (CD71 <8%) e alta apoptosi (Bcl-2B/T <1.6); 2) Bcl2CD71+ [49 pts] con alta proliferazione (CD71>8%) e bassa apoptosi (Bcl-2B/T >1.6); e 3) Bcl2CD71+/- [110 pts] con bassa proliferazione e bassa apoptosi oppure con alta proliferazione e alta apoptosi. I pazienti affetti da LLC-B ZAP-70+ erano 95/265 (36%). In 111 pazienti studiati l’espressione di ZAP-70 e lo stato mutazionale del gene Ig V gene erano significativamente correlati (p<0.00001). Inoltre, noi trovammo una significativa associazione sia tra bassi livelli di ZAP-70 e basso Bcl-2B/T index (p=0.001) o basso livello di ZAP-70 e Bcl2CD71- (p=0.002), confermando che bassi livelli di ZAP-70 erano caratterizzati da elevata apoptosi e bassa proliferazione. In riferimento al decorso clinico, una significativa più corta sopravvivenza libera da progressione (PFS) fu osservata nei pazienti ZAP-70+ vs pazienti ZAP-70 negative (0% vs 58% a 13 anni; p<0.00001) e in pazienti Bcl2CD71+ vs pazienti Bcl2CD71- (10% vs 56% a 12 anni; p<0.00001). Il sottogruppo Bcl2CD71+/- mostrava un decorso intermedio (30% a 12 anni). Per analizzare ulteriormente l’impatto prognostico dell’indice Bcl2CD71, noi valutammo la sua espressione all’interno dei pazienti ZAP70+ (95 pts) e ZAP70- (170 pts). In realtà, Bcl2CD71 non fu in grado di identificare un livello prognostico all’interno dei pazienti ZAP-70+, perchè tutti questi pazienti presentavano una più corta PFS senza significative differenze. Del resto, questo indice identifica un livello differente di PFS all’interno del sottogruppo ZAP-70 negativo (73% dei pazienti per Bcl2CD71- vs 29% dei pazienti per Bcl2CD71+ a 12 anni, p=0.00009). Operando una analisi multivariata della PFS, nella quale l’età, lo stadio di Rai modificato, CD38, CD23 solubile (sCD23), raddoppiamento dei linfociti (LDT), Bcl-2CD71 e ZAP-70, ZAP-70 (p=0.00005), LDT (p=0.006), stadio Rai modificato (p=0.03) e sCD23 (p=0.01) risultarono essere dei fattori prognostici indipendenti. Inoltre, si confermò che ZAP-70 era il principale fattore prognostico indipendente con riferimento alla PFS. Del resto, il nostro indice apoptosi/proliferazione (Bcl2CD71), eseguito utilizzando la citometria a flusso, fu molto utilizzato per identificare pazienti a differenti livelli di progressione all’interno del sottogruppo ZAP-70 negativo. Dal momento che ZAP-70 negativo rappresenta un ampio ed eterogeneo gruppo della popolazione di LLC-B con una progressione variabile, altri fattori biologici, come il livello di apoptosi e di proliferazione, devono essere considerati in modo che insieme possano identificare più facilmente i pazienti in progressione e dare modo di prendere in tempo una accurata decisione terapeutica.