Immunomodulatory properties of cholera toxin B subunit

Antigen-non-specific innate immunity and antigen-specific adaptive immunity synergize to eradicate invading pathogens through the actions of immune cells and their effector proteins, including complement, antibodies, cytokines and cytolytic factors. Adaptive immune responses are induced, coordinated and regulated by dendritic cells (DC). DC initiate immunity by the activation of naïve B and T cells - the effector cells of the adaptive immune system - and by the stimulation of natural killer cells - the crucial cellular instigators of innate resistance. Besides linking innate and adaptive immunity, DC limit excessive, tissue-damaging immune responses in order to prevent autoimmunity and non-essential reactions to innocuous agents through their ability to induce antigen-specific unresponsiveness of lymphocytes in primary and secondary lymphoid tissues by mechanisms that include deletion and induction of regulatory T cells (Tregs). Given the central role of these antigen presenting cells in immunity and tolerance, they are ideal therapeutic targets for pharmacological modulation of immune responses. In the present study, we examined the possibility that recombinant CTB (rCTB) may affect human DC functions in response to toll-like receptor (TLR) stimulation and may induce the generation of DC with the capacity to generate Tregs. CTB - cholera toxin B subunit - is an efficient mucosal carrier molecule for the generation of immune responses to linked antigens, since it facilitates entry into the cell of the CTB-antigen complex by ligation of its surface receptor GM1. There is also good evidence that CTB acts as an immunosuppressant, as it is able to down-modulate human monocyte/macrophage cell line activation and to suppress Th1-type responses. Our findings show that rCTB partially prevents the lipopolysaccharide (LPS)-induced maturation process of monocyte-derived DC (MDDC) and decreases their interleukin-12p70 (IL-12p70) production with no relevant effect on IL-10 production. LPS-stimulated MDDC pre-treated with rCTB are able to promote the induction of low proliferating T cells, which show an enhanced IL-10 production associated with a reduced interferon-γ (IFN-γ) production and the same high levels of trasforming growth factor-β (TGF-β) as the control. These T cells suppress proliferation of activated autologous T cells. Transwell experiments and blockade of IL-10R and TGF-β showed that the immunomodulatory effect is mediated by soluble factors. Thus, T cells induced by rCTB-conditioned MDDC acquire a regulatory phenotype and activity similar to those described for IL-10 producing type 1 Tregs (Tr1).

L'immunità innata antigene-non-specifica e l'immunità adattativa antigene-specifica collaborano per debellare i patogeni che invadono l'organismo tramite l'intervento delle cellule del sistema immunitario e delle loro molecole effettrici, che includono le proteine del complemento, gli anticorpi, le citochine e i fattori deputati alla lisi cellulare. Le risposte immunitarie adattative vengono indotte, coordinate e regolate dalle cellule dendritiche (DC). Le DC avviano le risposte immunitarie attivando i linfociti B e T naïve – che sono le cellule effettrici dell'immunità adattativa – e stimolando le cellule natural killer, che sono le principali cellule effettrici dell'immunità innata. Accanto al loro ruolo di collegamento tra immunità innata e adattativa, le DC hanno il delicato compito di limitare le risposte infiammatorie eccessive, che potrebbero causare danni tissutali, con lo scopo di prevenire l'insorgenza di reazioni indesiderate contro antigeni autologhi o innocui. A questo scopo, le DC inducono nei linfociti uno stato di “non-responsività” contro gli antigeni sia negli organi linfoidi primari che in quelli secondari, attraverso meccanismi che includono la delezione e l'induzione di cellule T regolatorie (Tregs). Dal momento che presentano questo ruolo centrale sia nell'immunità che nella tolleranza, le DC dimostrano di essere un candidato ideale come bersaglio di farmaci immunomodulanti. Nel presente studio abbiamo esaminato la possibilità che la CTB ricombinante (rCTB) possa influenzare le funzioni delle DC in risposta alla stimolazione tramite toll-like receptors (TLR), rendendo le DC capaci di indurre il differenziamento di Tregs. La CTB – la subunità B della tossina colerica – è un'efficace proteina trasportatrice a livello mucosale, in quanto facilita l'internalizzazione degli antigeni ad essa legati tramite l'interazione con il proprio recettore di membrana GM1, e favorisce l'attivazione delle risposte immunitarie dirette contro tali antigeni. Inoltre è stato dimostrato che la CTB agisce come un immunosoppressore, dal momento che è in grado di inibire l'attivazione delle linee cellulari monocito-macrofagiche e di sopprimere le risposte di tipo Th1. Le nostre ricerche dimostrano che la rCTB previene parzialmente la maturazione di DC derivanti da monociti (MDDC) indotta da lipopolisaccaride (LPS) e ne diminuisce la produzione di IL-12p70 senza influenzarne la produzione di IL-10. Le DC pretrattate con CTB e stimolate con LPS sono così in grado di promuovere l'induzione di cellule T scarsamente proliferanti che mostrano un'aumentata produzione di IL-10 associata ad una ridotta produzione di interferon-γ (IFN-γ) e ad analoghi elevati livelli di trasforming growth factor-b (TGF-β), quando paragonati a quelli delle cellule di controllo. Le cellule T così indotte sono capaci di sopprimere la proliferazione di cellule T autologhe attivate, tramite la produzione di fattori solubili, come dimostrano gli esperimenti effettuati mediante Transwell o con anticorpi bloccanti il recettore dell'IL-10 (IL-10R) ed il TGF-β. Tutte queste caratteristiche rendono le cellule T indotte da DC condizionate con rCTB simili alle Tregs di tipo 1 (Tr1) producenti IL-10.