Duplex real time RT-PCR per la determinazione del virus dell’epatite A in campioni di molluschi eduli lamellibranchi con l’utilizzo del Calicivirus Felino come controllo di processo

Food can transmit pathogens to humans of a bacterial or viral infection that can cause various diseases that, despite progress in prevention, are still a serious problem in public health. Bivalve shellfish is one of the main food correlated with outbreaks (infection and / or intoxication) in human. Shellfishes filter large volumes of water in which they live and concentrating in their body nutrient substances but also viruses and bacteria, may become an important source of risk for health. For this reason shellfishes represent a major cause of Hepatitis A infection in our country. Regulation of the European n.2073/2005 bases the assessment of the microbiological suitability of bivalve molluscs on the determination of bacteriological parameters (Salmonella and E. coli). The same regulation stresses, however, that the determination of the indicators is not reliable faecal to demonstrate the absence of viral contamination and to assess the effectiveness of the purification processes. The lack of an analytical method sufficiently sensitive, simple and reliable to be used in laboratories engaged in the official control laboratories does not allowe to define a microbiological criterion for the enteric viruses for the control of shellfish safety. In this thesis has a new method for determining HAV was developed. The method was evaluated using spiked shellfish samples. At the aim to indicate the absence of the reaction inhibitions and the efficiency of the procedure, a process control was added, extracted and amplified from the sample parallely with the target. As process control Feline Calicivirus (FCV) was chosen. A Duplex Real Time PCR was developed for determining simultaneously both the HAV and FCV using two probes labelled with different fluorochromes. The probe specific for the HAV determination was marked at 5’ with FAM and the FCV specific one with VIC. Both probes were quenched at 3’ using TAMRA. The effectiveness of two methods of extraction and concentration of the HAV virus from shellfish hepatopancreas was also evaluated.

I prodotti alimentari possono trasmettere all’uomo agenti patogeni di natura batterica o virale in grado di provocare varie patologie che, nonostante i progressi nel settore della prevenzione, rappresentano ancora oggi un grave problema nel settore della sanità pubblica. Tra i principali alimenti fonte di infezione e/o di intossicazione, i molluschi bivalvi che vivono filtrando l’acqua e concentrando nel loro organismo oltre alle sostanze nutrienti anche virus e batteri, possono diventare un’importante fonte di rischio per la salute. Per tale motivo il loro consumo, diffuso anche in Italia, rappresenta una delle maggiori cause di infezione di Epatite A nel nostro Paese. Il regolamento della Commissione Europea (CE) n.2073/2005 basa il giudizio di idoneità microbiologica dei molluschi bivalvi sulla determinazione di parametri batteriologici (Salmonella ed E.coli). Lo stesso regolamento sottolinea, però, che la determinazione degli indicatori fecali non risulta affidabile per dimostrare l’assenza di contaminazione virale e per valutare i tempi dei processi di depurazione. L’assenza di un criterio microbiologico per la determinazione diretta dei virus enterici per il controllo dei molluschi nasce dalla mancanza di un metodo di analisi sufficientemente sensibile, semplice e affidabile da poter essere impiegato nei laboratori addetti al controllo ufficiale. In questa sperimentazione è stato sviluppato un nuovo metodo per la determinazione dell’HAV partendo da campioni di epatopancreas di molluschi eduli lamellibranchi artificialmente contaminati. Inoltre, tenendo conto della complessità della matrice di partenza e della sua ricchezza di inibenti, è stato studiato l’utilizzo di un controllo di processo che aggiunto al campione ed estratto ed amplificato insieme alla sequenza target è stato in grado di indicare la possibile presenza di falsi negativi. A tal fine è stato scelto come controllo di processo il Calicivirus Felino (FCV) ed è stata sviluppata una Duplex Real Time PCR in grado di determinare contemporaneamente sia l’HAV che l’FCV utilizzando due sonde marcate con differenti fluorocromi. La sonda specifica per la determinazione dell’HAV è stata marcata all’estremità 5’ con FAM mentre quella specifica per l’FCV con VIC. Ambedue le sonde sono state legate all’estremità 3’ con TAMRA che funge da quencher. Utilizzando tale metodica si è valutata anche l’efficacia di due metodi di estrazione e concentrazione del virus dell’HAV partendo sempre da campioni di epatopancreas di molluschi, il primo metodo si è basato sull’utilizzo della proteinasi K, mentre il secondo sull’impiego di glicina/PEG/Cloroformio-Butanolo/CatFloc.