Melanoma cells differentiation through inhibition of p-Mek activity following treatment with 5,7-dimethoxycoumarin

In this work the antiproliferative activity of 5,7-dimethoxycoumarin, a plant secondary metabolite, on murine (B16) and human (A375) melanoma cells was analysed. The compound reduced significatively cell proliferation in time and dose-dependent manner blocking cell cycle in G0/G1 phase, in both cell lines. Also a differentiation process, following this block, was detected by monitoring some specific markers such as morphological changes with development of dendrite-like projections from cell surface, melanin synthesis and protoporphyrine IX (PpIX) accumulation. Taking into account the antiproliferative and differentiation activities of this compound, we examined Ras/Raf/Mek/Erk mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity following treatment; this kinases pathway regulates cell survival, proliferation and differentiation processes and it is costitutively activated following mutations in 70 % of melanoma. Inhibition of Mek 1/2 kinase activity and subsequent reduction in Erk 1/2 activation were detected in both cell types. Furthermore, we analyzed melanogenesis process by monitoring the phosphorylation of cAMP-response element-binding protein (p-CREB) and the expression of microphthalmia-associated transcription factor (Mitf); also tyrosynase activity was investigated. Mitf is involved in differentiation, proliferation and survival of melanocyte and melanoma cells since it regulates transcription of genes encoding for proteins involved in cell cycle progression or in melanogenesis, such as the enzyme tyrosinase, the key enzyme in melanin synthesis. Transcriptional activity of Mitf is regulated also through the phosphorylation of CREB that upregulates its gene transcription. We detected that CREB phosphorylation and Mitf expression enhanced significantly following 5,7-dimethoxycoumarin treatment in melanoma cells; consequently, an increase of tyrosinase activity was observed. These findings suggest that 5,7-dimethoxycoumarin exerts an antineoplastic activity in murine and human melanoma cells, triggering a differentiation process with stimulation of melanin synthesis. It will be of note to carry out in vitro analyses to investigate the antimetastatic activity of the tested compound; and in vivo studies with the aim to demonstrate cancer antigrowth and antimetastatic properties of compound also in preclinical trials.

In questo lavoro è stata studiata l’attività antineoplastica della 5,7-dimetossicumarina, un metabolita secondario di origine vegetale, su cellule di melanoma murino (B16) e umano (A375). Il composto riduce significativamente la proliferazione cellulare in modo dose e tempo dipendente, bloccando nella fase G0/G1 il ciclo di entrambe le linee cellulari. In seguito a questo blocco, è stato inoltre osservato un processo di differenziamento nelle cellule trattate attraverso l’analisi di markers specifici quali lo sviluppo di proiezioni dendritiche dalla superficie cellulare, l’incremento nella sintesi di melanina e l’accumulo della protoporfirina IX (PpIX). Considerando le attività antineoplastica e differenziativa della 5,7-dimetossicumarina, è stato esaminato il suo effetto sulla fosforilazione, e quindi sull’attività, delle protein chinasi attivate da mitogeni Ras/Raf/Mek/Erk (MAPK). Questa via chinasica regola la sopravvivenza, la proliferazione, e il differenziamento cellulari ed è costitutivamente attivata, in seguito a mutazioni, nel 70% dei casi di melanoma. Un’inibizione dell’attività chinasica di Mek 1/2 e una conseguente riduzione nell’attivazione di Erk 1/2 è stata osservata in entrambe le linee usate dopo incubazione delle cellule con la 5,7-dimetossicumarina. Inoltre, è stato investigato il processo di melanogenesi indotto dal trattamento andando a monitorare il grado di fosforilazione di CREB (proteina legante CRE), l’espressione di Mitf (fattore di trascrizione associato alla microftalmia) e l’attività della tirosinasi. Mitf è coinvolto nel differenziamento, nella proliferazione e nella sopravvivenza dei melanociti e delle cellule di melanoma, poiché regola la trascrizione di geni codificanti per proteine che controllano la progressione del ciclo cellulare o la melanogenesi, come la tirosinasi che è considerato l’enzima chiave nella sintesi di melanina. L’attività di Mitf è regolata da vari fattori, tra cui CREB che quando è fosforilato induce la trascrizione del gene corrispettivo. Noi abbiamo osservato che la fosforilazione di CREB e l’espressione di Mitf aumentano significativamente in seguito a trattamento con la 5,7-dimetossicumarina nelle cellule di melanoma; di conseguenza, un incremento nell’attività della tirosinasi è stato dimostrato. Questi risulatati suggeriscono che la 5,7-dimetosicumarina esercita un’attività antineoplastica nelle cellule di melanoma murino e umano, causando un processo di differenziamento con induzione di melanogenesi. Sarà interessante effettuare studi in vitro, per investigare un’eventuale attività antimetastatica del composto in esame, ed in vivo al fine di dimostrare le proprietà antineoplastiche e antimetastatiche della molecola anche in ambito preclinico.