Il danno mitocondriale modula lo splicing alternativo in cellule neuronali: implicazioni per la neurodegenerazione

Mitochondrial damage is linked to many neurodegenerative deseases, such as Parkinson, Alzheimer and Amyotrophic Lateral Sclerosis. These diseases are linked to changes in the splicing pattern of individual mRNAs. Here, we test the hypothesis that mitochondrial damage modulates alternative splicing, not only of a few mRNAs, but in a general manner. We incubated cultured human neuroblastoma cells with the chemical agent paraquat (a neurotoxin that interferes with mitochondrial function, causing energy deficit and oxidative stress) and analysed the splicing pattern of 13 genes by RT-PCR. For each alternatively spliced mRNA, we observed a dose and time dependent increase of the smaller isoforms. In contrast, splicing of all constitutive exons we monitored did not change after paraquat treatment. In addition, we prove that the modulation of alternative splicing by using different drugs correlates with ATP depletion, not with oxidative stress. Such drastic changes in alternative splicing haven’t been observed in cell lines of non-neuronal origin, suggesting a selective susceptibility of neuronal cells to modulation of splicing. Since a significant percentage of all mammalian mRNAs undergoes alternative splicing, we predict that mitochondrial failure will unbalance a large number of isoform equilibriums, thus permitting an important contribution to neurodegeneration. To identify possible drug targets, we tried to understand which is the signal trasduction trasmitting the mitochondrial damage to the splicing machinery. Two classes of proteins determine splice site selection: the hnRNP and the SR proteins. Both of them are phosphorylated and phosphorylation is important for their activity. We have purified hnRNPs and SR proteins from both paraquat-treated and human neuroblastoma control cells and we have studied them with a sub-proteomic approach. While the maps of paraquat-treated and control hnRNPs do not show up significant modifications, the SR proteins appear hypophosphorylated and downregulated by paraquat treatment. Finally, using different inhibitors involving different pathways in the cell, we demonstrate that calcium has a role in the signal trasduction that we are observing. The obtained data are not yet conclusive, but certainly have shown us a correlation between the neurodegeneration and Alternative Splicing. They have laid down the foundation for understanding the way by which the Alternative Splicing is modulated in neurons depending on external stimuli.

Il danno mitocondriale è associato a molte malattie neurodegenerative, quali: Parkinson, Alzheimer e Sclerosi Laterale Amiotrofica. Queste malattie sono associate anche a cambiamenti di isoforme tramite splicing alternativo di alcuni geni. In questo lavoro dimostriamo che il danneggiamento mitocondriale modula lo splicing alternativo in maniera generale. Cellule di neuroblastoma umano sono state incubate con l’agente chimico paraquat (una neurotossina che danneggia i mitocondri e crea stress ossidativo) e analizzate mediante RT-PCR per il pattern di splicing di 13 geni. Tutti gli mRNAs soggetti a splicing alternativo mostrano un’incremento dell’isoforma più piccola in maniera dose e tempo dipendente. Al contrario degli esoni alternativi, gli esoni costitutivi non cambiano dopo induzione con il paraquat. Dai dati ottenuti usando altre droghe, si evince che la modulazione dello splicing alternativo è correlata con il danno mitocondriale e la conseguente mancanza di ATP. Linee cellulari non neuronali non mostrano gli stessi cambiamenti nello splicing, indicando una selettiva suscettibilità delle cellule neuronali. Dato che una significativa percentuale di mRNAs di mammiferi è sottoposta a splicing alternativo, abbiamo ipotizzato che il danneggiamento mitocondriale causi uno squilibrio tra le varie isoforme dando un importante contributo alla neurodegenerazione. Con lo scopo di identificare eventuali targets farmacologici, abbiamo cercato di capire quale sia la via di trasduzione del segnale che trasmette lo stress mitocondriale al macchinario dello splicing. Due classi di proteine determinano la selezione dei siti di splicing: la famiglia delle proteine SR e la famiglia delle proteine hnRNP; entrambe regolate dalla fosforilazione, che è importante per la loro attività. Le proteine hnRNP ed SR sono state purificate da cellule di neuroblastoma umano di controllo e trattate con paraquat e studiate mediante un approccio sub-proteomico. Mentre le proteine hnRNPs non mostrano cambiamenti, le proteine SR sembrano essere down regolate e defosforilate in seguito a trattamento con il paraquat. Infine, utilizzando diversi inibitori che coinvolgono diversi pathway presenti nella cellula, abbiamo dimostrato che il calcio ha un ruolo nella via di trasduzione del segnale che stiamo osservando. I dati ottenuti non sono ancora conclusivi, ma sicuramente hanno dimostrato una correlazione fra la neurodegenerazione e lo splicing alternativo e hanno posto le basi per capire il modo in cui lo splicing alternativo è modulato nei neuroni in risposta a stimoli esterni.