Our study is focused on the importance that NGF could have in the molecular mechanisms that regulate the muscular system analyzing its effective role on growth, survival and differentiation of myogenic cells. We performed an in vitro protocol utilizing L6C5 rat skeletal myoblasts, already characterized by our group. L6C5 myoblasts and myotubes were exposed to different concentrations of exogenous NGF (20ng/ml) and were then collected at different time during differentiation to be analyzed for cell growth and survival (MTS assay) the expression of specific myogenic markers (Myogenin and MHC), fusion rate (immunocytoquimical analysis), NFkB activation (Elisa assay), and induction of apoptosis (nuclear fragmentation, Tunel). Studying the influence of the neurotrophic factor on cell growth, we verified that NGF is able to sustain myoblast survival in FBS-free medium, but it cannot induce changes in the rate of cell growth. As regards the effective role on differentiation we demonstrated that NGF (20ng/ml) determines an increase in the differentiative potential of this cell line inducing an over-expression of myogenin in the first phases of the process (2 days in DM), with a consequent hypertrophy of fibers due to an increase in the fusion rate. On the contrary the MHC expression, a terminal differentiation marker, seems not be modulated by NGF. At the same differentiation step (2 days from DM), we found that NGF (20ng/ml) modulates the activity of NFkB, possibly leading to decrease of L6C5 cell susceptibility to apoptosis induced by oxidative stress. When L6C5 myoblasts were maintained in the proliferation medium (GM), NGF can improve the L6C5 myoblast survival towards oxidative stress, but without modifying their susceptibility to apoptosis, or the binding activity of NFkB. Since the p75 low affinity receptor resulted the only one expressed in L6C5 myoblasts and myotubes, we blocked its endogenous action trough an anti-p75 mAb, but this inhibition did not cause a significant increase of apoptotic nuclei, suggesting that the transduction pathway activated by p75 is not the main process involved in the susceptibility of L6C5 myoblasts to apoptotic death. Indeed, although L6C5 cells did not express TrkA receptor, our cellular model is sensitive to treatments with a specific TRK receptor’s inhibitor (AG879), which caused a significant decrease in cell survival together with a reduction in Akt phosphorylation and apoptotic proteolysis of poli (ADP ribose) polymerase enzyme (PARP).

Utilizzando un modello in vitro, la linea di mioblasti di ratto L6C5, ci siamo interessati di analizzare il ruolo del fattore di crescita neuronale, NGF, sulla crescita, differenziamento e sopravvivenza cellulare in seguito a stimolo apoptotico indotto da dosi citotossiche di perossido d’idrogeno. Mioblasti e/o miotubi L6C5 sono stati coltivati in condizioni standard o in presenza di differenti concentrazioni di NGF (20-100ng/ml), raccolti a diversi tempi durante il corso del differenziamento e analizzati per: a) crescita e sopravvivenza cellulare (saggio MTS, apoptosi); b) espressione di alcuni marcatori specifici del differenziamento (miogenina e MHC); c) tasso di fusione dei mioblasti (immunocitochimica); d) attivazione della via di trasduzione del segnale (NFkB, AKT). Riguardo l’influenza che il fattore neurotrofico può avere sulla crescita cellulare, abbiamo verificato che NGF è in grado di sostenere la crescita dei mioblasti L6C5 anche se vengono coltivati in terreno privo di siero, ma non è in grado di modificare sostanzialmente il potenziale proliferativo di queste cellule. Per quanto riguarda gli effetti sul differenziamento abbiamo dimostrato che la presenza di NGF (20 ng/ml) induce una sovra-espressione di miogenina nelle prime fasi di differenziamento (2 giorni in DM), con conseguente ipertrofia delle fibre che, in presenza di NGF, mostrano un indice di fusione maggiore. Analogamente alla miogenina, NGF modula l’espressione di NFkB solo durante la prima fase del processo differenziativo (2 giorni in DM), e l’incremento di attività di questo fattore di trascrizione è possibilmente correlata con una minore sensibilità all’apoptosi indotta da H2O2 in una fase più avanzata del differenziamento (6 giorni). Sui mioblasti L6C5 mantenuti in terreno proliferativo (GM), NGF migliora la sopravvivenza a dosi citototossiche di perossido d’idrogeno, senza però mostrare differenze riguardo l’attivazione di NFkB e, di conseguenza, nella suscettibilità all’apoptosi. Abbiamo verificato poi che l’inibizione di p75NTR, l’unico recettore ad essere espresso in queste cellule, non comporta un aumento nella percentuale di nuclei apoptotici, suggerendo che la via di trasduzione attivata da tale recettore non può essere il processo maggiormente coinvolto nell’attivazione del processo apoptotico nei mioblasti L6C5. Sebbene l’analisi per RT-PCR non dimostri la presenza nelle cellule L6C5 di mRNA per TrkA, la nostra linea cellulare mostra chiaramente una particolare sensibilità al AG879, un inibitore specifico per alcuni recettori tirosin chinasici, compreso TrkA, VEGFR e EGFR. La presenza di AG879 in coltura determina una riduzione drastica della sopravvivenza cellulare, una riduzione nella fosforilazione di AKT e la proteolisi apoptotica dell’enzima poli (ADP ribosio) polimerasi (PARP).

De Perini, A. (2008). NGF e regolazione del sistema muscolare: effetto sul differenziamento e sulla sopravvivenza delle cellule miogeniche.

NGF e regolazione del sistema muscolare: effetto sul differenziamento e sulla sopravvivenza delle cellule miogeniche

DE PERINI, ALESSANDRA
2008-05-28

Abstract

Our study is focused on the importance that NGF could have in the molecular mechanisms that regulate the muscular system analyzing its effective role on growth, survival and differentiation of myogenic cells. We performed an in vitro protocol utilizing L6C5 rat skeletal myoblasts, already characterized by our group. L6C5 myoblasts and myotubes were exposed to different concentrations of exogenous NGF (20ng/ml) and were then collected at different time during differentiation to be analyzed for cell growth and survival (MTS assay) the expression of specific myogenic markers (Myogenin and MHC), fusion rate (immunocytoquimical analysis), NFkB activation (Elisa assay), and induction of apoptosis (nuclear fragmentation, Tunel). Studying the influence of the neurotrophic factor on cell growth, we verified that NGF is able to sustain myoblast survival in FBS-free medium, but it cannot induce changes in the rate of cell growth. As regards the effective role on differentiation we demonstrated that NGF (20ng/ml) determines an increase in the differentiative potential of this cell line inducing an over-expression of myogenin in the first phases of the process (2 days in DM), with a consequent hypertrophy of fibers due to an increase in the fusion rate. On the contrary the MHC expression, a terminal differentiation marker, seems not be modulated by NGF. At the same differentiation step (2 days from DM), we found that NGF (20ng/ml) modulates the activity of NFkB, possibly leading to decrease of L6C5 cell susceptibility to apoptosis induced by oxidative stress. When L6C5 myoblasts were maintained in the proliferation medium (GM), NGF can improve the L6C5 myoblast survival towards oxidative stress, but without modifying their susceptibility to apoptosis, or the binding activity of NFkB. Since the p75 low affinity receptor resulted the only one expressed in L6C5 myoblasts and myotubes, we blocked its endogenous action trough an anti-p75 mAb, but this inhibition did not cause a significant increase of apoptotic nuclei, suggesting that the transduction pathway activated by p75 is not the main process involved in the susceptibility of L6C5 myoblasts to apoptotic death. Indeed, although L6C5 cells did not express TrkA receptor, our cellular model is sensitive to treatments with a specific TRK receptor’s inhibitor (AG879), which caused a significant decrease in cell survival together with a reduction in Akt phosphorylation and apoptotic proteolysis of poli (ADP ribose) polymerase enzyme (PARP).
28-mag-2008
A.A. 2007/2008
Scienze e biotecnologie della riproduzione e dello sviluppo
20.
Utilizzando un modello in vitro, la linea di mioblasti di ratto L6C5, ci siamo interessati di analizzare il ruolo del fattore di crescita neuronale, NGF, sulla crescita, differenziamento e sopravvivenza cellulare in seguito a stimolo apoptotico indotto da dosi citotossiche di perossido d’idrogeno. Mioblasti e/o miotubi L6C5 sono stati coltivati in condizioni standard o in presenza di differenti concentrazioni di NGF (20-100ng/ml), raccolti a diversi tempi durante il corso del differenziamento e analizzati per: a) crescita e sopravvivenza cellulare (saggio MTS, apoptosi); b) espressione di alcuni marcatori specifici del differenziamento (miogenina e MHC); c) tasso di fusione dei mioblasti (immunocitochimica); d) attivazione della via di trasduzione del segnale (NFkB, AKT). Riguardo l’influenza che il fattore neurotrofico può avere sulla crescita cellulare, abbiamo verificato che NGF è in grado di sostenere la crescita dei mioblasti L6C5 anche se vengono coltivati in terreno privo di siero, ma non è in grado di modificare sostanzialmente il potenziale proliferativo di queste cellule. Per quanto riguarda gli effetti sul differenziamento abbiamo dimostrato che la presenza di NGF (20 ng/ml) induce una sovra-espressione di miogenina nelle prime fasi di differenziamento (2 giorni in DM), con conseguente ipertrofia delle fibre che, in presenza di NGF, mostrano un indice di fusione maggiore. Analogamente alla miogenina, NGF modula l’espressione di NFkB solo durante la prima fase del processo differenziativo (2 giorni in DM), e l’incremento di attività di questo fattore di trascrizione è possibilmente correlata con una minore sensibilità all’apoptosi indotta da H2O2 in una fase più avanzata del differenziamento (6 giorni). Sui mioblasti L6C5 mantenuti in terreno proliferativo (GM), NGF migliora la sopravvivenza a dosi citototossiche di perossido d’idrogeno, senza però mostrare differenze riguardo l’attivazione di NFkB e, di conseguenza, nella suscettibilità all’apoptosi. Abbiamo verificato poi che l’inibizione di p75NTR, l’unico recettore ad essere espresso in queste cellule, non comporta un aumento nella percentuale di nuclei apoptotici, suggerendo che la via di trasduzione attivata da tale recettore non può essere il processo maggiormente coinvolto nell’attivazione del processo apoptotico nei mioblasti L6C5. Sebbene l’analisi per RT-PCR non dimostri la presenza nelle cellule L6C5 di mRNA per TrkA, la nostra linea cellulare mostra chiaramente una particolare sensibilità al AG879, un inibitore specifico per alcuni recettori tirosin chinasici, compreso TrkA, VEGFR e EGFR. La presenza di AG879 in coltura determina una riduzione drastica della sopravvivenza cellulare, una riduzione nella fosforilazione di AKT e la proteolisi apoptotica dell’enzima poli (ADP ribosio) polimerasi (PARP).
NGF; p75NTR; myogenic cells
Settore MED/07 - MICROBIOLOGIA E MICROBIOLOGIA CLINICA
Italian
Tesi di dottorato
De Perini, A. (2008). NGF e regolazione del sistema muscolare: effetto sul differenziamento e sulla sopravvivenza delle cellule miogeniche.
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