Caratterizzazione strutturale e funzionale della topoisomerasi IB umana e dei suoi mutanti

Human DNA topoisomerase IB (topo IN) is an essential monomeric enzyme involved in resolving the torsional stress assiciated with DNA replication, trascription and chromatin condensation. Topo IB catalyzes changes in the supehelical state of the duplex DNA by transiently breaking a single strand allowing the broken strand to move through the break. Phosphodiester bond energy is preserved during catalysis through the formation of a transient phosphotyrosine bond between the active-site tyrosine and the 3' end of the broken strand. According to X-ray crystallography and biochemical analysyses topo IB is organized into four domains: N-terminal domain,core, linker and C-terminal domain which contains the active site Tyr723. The topo IB is also an important target of the antitumor drug camptothecin for chemotherapy of uman cancers. The biochemical and structural-dynamical properties of the Asp677Gly-Val703Ile double mutant displaying a pronounced CPT sensitivity as been investigated to better understad the action mechanism of the enzyme and the interaction of CPT with the cleavable topoI-DNA complex. The results have shown that the CPT hypersensitivity of the mutations its done to a reduction of its religation rate and demonstrated the occurrence of a long range communication between domains localized far away one from the other.The inhibition efficiency on human topo IB wild type of the cEPA has been investigated analyzing the different steps of the enzyme catalytic cycle. The experiments show that cEPA has a mechanism different from CPT, inhibiting the cleavage of the enzyme on the DNA although permitting the non covalent enzyme-DNA interaction. The human topoI N-terminal domain is the only region of the enzyme with an unknown 3D structure since it is not possible to crystallize it. This domain has been overproduced into E.coli BL21,to carry out preliminary spectroscopic analysis consisting of CD, fluorescence and NMR spectra. The spectra indicate an equilibrium between the structured and unstructured regions. We are now producing the isotope labeled protein,growing the bacterial cells in minimum medium containing N15,in the attempt to gain further structural information by high-field 2D NMR spectroscopy.

La DNA topoisomerasi IB umana è un enzima monomerico essenziale nel risolvere problemi topologici generati durante procesi chiave nucleari quali la replicazione, trascrizione, combinazione e riparazione del DNA. Latopo IB rilassa DNA superavvolti sia negativi che positivi in assenza di cationi metallici, attraverso la rottura transiente di un singolo filamento di DNA. Durante il ciclo catalitico il residuo Tyr723 viene usato come nucleofilo per rompere il legame fosfodiesterico del backbone del DNA generando un complesso covalente enzima-DNA all'estremità 3' del filamento tagliato. Il gruppo ossidrile 5' del filamento tagliato è libero di ruotare e di agire come nucleofilo attaccando il gruppo fosfato per rompere il legame tra il DNA e l'enzima risaldando il filamento precedentemente tagliato. Secondo studi cristallografici e di proteolisi limitata la topo IB è organizzata in quattro domini: N-terminale, core, linker e C-terminale che contiene il residuo attivo della Tyr723. L'enzima inoltre risulta essere l'unico bersaglio di farmaci chemioterapici quali la camptotecina ed i suoi derivati. Studi di mutanti ipersensibili, come la topoisomerasi I Asp677Gly-Val703Ile, permettono di comprendere i meccanismi alla base del funzionamento dell'enzima e della sua interazione con la droga ed intercorrelazione tra i diversi domini proteici. A tal fine sono stati eseguiti saggi di caratterizzazione biochimica del mutante in vivo ed in vitro analizzando le principali fasi del ciclo. Lo sviluppo sempre maggiore di nuovo farmaci antitumorali ci ha portato a volgere l'attenzione sull'effetto inibitorio del cEPA e a comprenderne il meccanismo. Gli esperimenti mostrano che il cEPA ha un meccanismo differrente dalla CPT inibendo il taglio dell'enzima sul DNA substrato sebbene permetta la formazione del complesso non covalente enzima-DNA. Di particolare interesse è il dominio N-terminale, in quanto è l'unica regione dell'enzima con una struttura 3D sconosciuta, in quanto non è possibile cristallizzarla. Il dominio è stato overespresso in E. coli BL21 come proteina di fusione con la GST. Sono stati esegiuti studi preliminari di struttura mediante tecniche spettroscopiche di fluorescenza, di dicroismo circolare e di NMR monodimensionale. Questi spettri indicano un eqiuilibrio tra regioni strutturate e non strutturate, ma per ricevere ulteriori informazioni strutturali è necessario eseguire spettri NMR bidimensionali producendo il dominio marcato con isotopi N15 e C13.