Meccanismi di immunosoppressione in corso di sepsi: ruolo del sistema monocito-macrofagico

Background. During the late stages of sepsis, deterioration of the immune response occurs, which is characterized by suppression of both macrophage and lymphocyte immune function. CD40 is a 50- kD molecule expressed on different cell types including monocyte-macrophages. Human form of a ligand for CD40 (CD40L) is a type II integral membrane protein expressed primarily on activated CD4+ T cells. Upon CD40 engagement, monocytic cells secrete a vast array of cytokines, among them, interleukin (IL)-12 and tumor necrosis factor (TNF)-α, which are important in promoting and maintaining T-helper (Th)1 and pro-inflammatory responses during bacterial infection. CD40L activation of macrophages also results in the up-regulation of surface molecules, such as CD40, CD80 and CD86, which play a critical role in T cell activation. Thus, CD40-CD40L interaction is an essential step for triggering the adaptive immune response, and is very likely to play a prominent role during sepsis, as demonstrated by the increased mortality observed in septic animals with mutations of the CD40L gene. Recently, our Group of research reported that Lipopolysaccharide (LPS), a major cell wall component of Gram-negative bacterial organisms interfere with the ability of CD40L to activate macrophages to produce IL-12 and TNF-α and to up regulate CD40, CD80 and CD86. Aims. To study the responsiveness of macrophages to CD40L in patients with sepsis. Material and methods. Patients. Twenty patients_with gram-negative sepsis_ and 15 healthy controls were enrolled in this study. Inclusion criteria microbiologically proved infection, evidence of systemic inflammatory reaction syndrome (SIRS) plus two or more of the following: systolic pression <90 mmHg or mean arterial pression <70 mmHg, responsive to normal saline administration; diuresis <0.5 mL/kg/h; PaO2/FiO2<250, platelets <80,000/μL; pH <7,30 o base deficit >5,0 mEq/L or lactate >1,5 fold. Exclusion criteria: age <18 anni; HIV infection, previous organ transplantation, metastatic neoplasms; immunosoppressive therapy, chronic renal failure, pregnancy. Cells. Peripheral blood was enriched for PBMC by centrifugation over Ficoll Hypaque. PBMC were then further enriched for monocytes by elutriation. Cell stimulation. To evaluate the ability of CD40L to induce IL-12 and TNF-α production, freshly elutriated cells were cultured for 24 hours in the presence of 500 ng/ml CD40L. Thirty minutes after CD40L stimulation, 1 μg/ml brefeldin A was added. To evaluate the ability of CD40L to modulate the expression of CD40, CD80 and CD86, elutriated cells were cultured for 7 days in the presence of 500 ng/ml CD40L. At the end of the incubation period the cells were analyzed by FACS for CD40, CD80 and CD86 expression. FACS analysis. Flow cytometry was performed using a FACScan flow cytometer and analyzed with Cell Quest software (Beckton Dickinson). Results. The CD40L-induced production of both IL-12 and TNF-α was severely impaired (more than 60%) in macrophages from septic patients as compared to controls. Similarly, CD40L failed to induce an increase of CD40, CD80 and CD86 surface expression comparable to that obtained in macrophages from healthy subjects. Consequently, the co-stimulatory ability of CD40Lstimulated macrophages from septic patients was significantly lower than that observed in macrophages from controls. Interestingly, no alteration of the ability of T lymphocytes to produce interferon (IFN)-γ upon CD3/CD28 stimulation was demonstrated in septic patients ac compared to controls. Conclusions. Death due to hyper activation of the innate immune system is an uncommon result of sepsis. Moreover, immunomodulatory therapy directed at inhibition of the inflammatory response has been largely unsuccessful. Indeed, it has been observed that subsequent to septic shock there often follows a clinical state characterized by profound immunosuppression. Modern medicine is now able to potentially control acute hyperinflammatory situations, but there is no established therapy to deal with the high risk associated with immunosuppression. We propose that CD40L tolerance may explain some of the immunological dysfunction during sepsis and may individuate a possible pathway to be addressed in the development of novel therapeutic strategies.

Introduzione. Durante le fasi avanzate della sepsi è presente uno stato di immunosoppressione caratterizzato da alterazione della funzionalità sia dei macrofagi che dei linfociti. Di fatto, la principale causa di morte nei pazienti settici non è l'insufficienza d’organo multisistemica, associata a shock quanto piuttosto le conseguenze dello sviluppo incontrollato di infezioni secondarie di tipo “opportunistico”. Nelle sepsi da batteri Gram-negativi il lipopolisaccaride (LPS) batterico svolge un ruolo chiave nel determinare questa disfunzione immunitaria. A questo riguardo, il nostro Gruppo di Ricerca ha recentemente dimostrato che LPS è in grado di interferire con la produzione di l'interleuchina 12 (IL-12) e del fattore di necrosi tumorale (TNF-α) e con l'espressione di molecole co-stimolatorie (CD40, CD80 e CD86) indotte daCD40L. L'interazione tra il CD40L, espresso dai linfociti T attivati ed il CD40, un recettore presente sulla membrana dei monocito-macrofagi, determina un’attivazione delle cellule monocito-macrofagiche che si concretizza nella produzione di citochine (IL-12 e TNF-α), nell'aumento di espressione di molecole costimolatorie (CD40, CD80, CD86) ed, in ultima analisi, nel corretto sviluppo della risposta immune umorale e cellulare. Alterazioni, congenite o acquisite del meccanismo di attivazione macrofagico mediato dal CD40L si riflettono in stati di grave immunosoppressione. L'obiettivo di questa ricerca è di verificare se nei pazienti settici si verifichi una alterazione della capacità dei monocito-macrofagi di rispondere all'attivazione con CD40L. Materiali e metodi Pazienti. Sono stati arruolati 20 pazienti con sepsi e 15 controlli sani paragonabili per età e sesso. Criteri di inclusione: evidenza microbiologica di infezione presenza di SIRS e almeno due dei seguenti segni di disfunzione d’organo: pressione arteriosa sistolica <90mmHg o pressione arteriosa media <70 mmHg, stabilizzabile mediante fluido-terapia; diuresi <0.5mL/kg/ora; PaO2/FiO2<250, conta piastrinica <80,000/μL; pH <7,30 o deficit di basi >5,0 mEq/L o lattati aumentati di 1,5 volte. Criteri di Esclusione: età <18 anni; infezione da HIV, storia di trapianto d’organo,neoplasie metastatiche; trattamento con farmaci immunosoppressori, insufficienza renale cronica in fase dialitica, gravidanza in atto. Cellule. Le cellule mononucleate da sangue periferico (PBMC) sono state separate mediante centrifugazione su gradiente di densità. I monocito-macrofagi sono stati successivamente purificati mediante centrifugazione contro-corrente. Le cellule sono state coltivate in RPMI con aggiunta di Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor (100 UI). Per la stimolazione è stato utilizzato CD40Ltrimerico solubile ricombinante. Citofluorimetria. La produzione intracellulare di citochine e l’espressione di membrana di CD40, CD86 e CD80 sono state valutate al citofluorimetro (FACS). Risultati. I monocito-macrofagi prelevati da pazienti con sepsi presentavano una grave riduzione della capacità di rispondere alla stimolazione con CD40L sia per quanto riguarda la produzione di citochine che per quanto concerne l’espressione di CD40, CD86 e CD80, rispetto a monocito-macrofagi espiantati da donatori sani. Di conseguenza, anche la capacità di co-stimolazione dei linfociti T da parte dei macrofagi prelevati da pazienti con sepsi era gravemente compromessa rispetto a quella osservata nei macrofagi ottenuti da soggetti sani. Da rilevare il fatto che non era stato possibile evidenziare alcuna alterazione nella capacità dei linfociti T da pazienti settici di rispondere con la produzione di interferone (IFN)-γ alla stimolazione con CD3/CD28. Quest'ultimo dato suggerisce che l'alterazione funzionale dei macrofagi del paziente settico sia specifica e non dovuta ad una generale tossicità cellulare legata alla sepsi stessa. Discussione I dati presentati in questo lavoro mettono in evidenza, per la prima volta, la presenza in corso di sepsi di una alterazione della trasduzione del segnale mediato dal CD40 che condiziona la possibilità da parte delle cellule monocito-macrofagiche di rispondere con appropriatezza alla stimolazione da parte del CD40L. I risultati di questo lavoro possono contribuire in maniera sostanziale a definire i meccanismi che sono alla base dell'immunosoppressione in corso di sepsi e fornire possibili indicazioni per eventuali interventi di tipo terapeutico.