Studio funzionale della transglutaminasi 3 e di p63 nel differenziamento epidermico mediante l'uso di modelli murini

SHORT ABSTRACT Epidermal differentiation begins with the migration of keratinocytes from the basal layer and ends with the formation of the cornified layer. Cell proliferation, differentiation and death occur sequentially and each process is characterized by the expression of specific proteins. Transglutaminases (TGases) play an important role during the differentiation program. These enzymes catalyse post-translational modifications of proteins by the formation of isopeptide bonds (a cross-linking reaction). The cross-linked products, often of high molecular mass, are highly resistant to mechanical challenge and proteolytic degradation. In mammals, nine distinct TGase isoenzymes have been identified at the genomic level. Four TGases are expressed in the epidermis (TGase 1, TGase 2, TGase 3 and TGase 5) and the last three TGases show also a GTPase activity. TGM1-/- knock-out mice show severe epidermal abnormalities and they dye soon after birth, while TGM2 -/- knock-out mice dont’show any epidermal abnormality. During the complex mechanism that leads to epidermis formation an important role is played by the action of p63. This transcription factor, belonging to the p53 gene family, is transcribed from two different promoters, generating two classes of proteins: one containing an N-terminal transactivation domain (TA) and another that lacks this domain (∆N). The first isoform is considered the transcriptional inducer whereas ∆N could exert a role of dominant negative. In addition alternative splicing at the 3’ end of both transcripts (TA and ∆N) generates three different C-terminal splicing variants: α, β and γ. Mice p63-/- show severe limb, cranofacial and skin defects and die soon after birth. The aim of this work is to acquire new knowledges in the complex mechanism that leads to epidermal differentiation thanks to the investigation of TGase 3 and p63 function during the skin process formation. Regarding TGase 3 we plan to create conditional knock-out mice for this ezyme using the Cre/loxP system. During our work we isolated also two novel splicing variants for the TGM3 gene. The first one, isolated in mouse, lacks exons six and seven (∆6∆7), while the second one, isolated in NHEK cells, lacks of exons nine and ten (∆9∆10). The experiment demonstrated that the ∆9∆10 is at least 4 times less active than the wild type one, while ∆6∆7 is inactive because it lacks of the catalytic cysteine Regarding to the GTPase, it is lost in both splicing variants because several residues, that are important for the creation of the GTP pocket, are missed. In the second part of this work, we isolated a new p63-target gene: Scotin. This gene was previously isolated as a p53-inducible proapoptotic gene and the protein is located in the endoplasmic reticulum and in the nuclear membrane. Scotin expression is induced in response to endoplasmic reticulum (ER) stress in a p53 dependent or independent manner and this event lead to apoptosis. RT-qPCR showed that Scotin transcript is positively regulated by TAp63α in vitro, while ∆N isoform inhibits its expression. Western blot experiments, performed on differentiating mouse and human primary keratinocytes, revealed Scotin upregulation following the differentiation program. Immunofluorescence performed on mouse new born skin sections demontrated that Scotin expression is located in the suprabasal layer of epidermis where TAp63, but not ∆Np63 is expressed. In conclusion our data lead to isolation of a new p63 target gene induced during the epithelial differentiation program, a complex process that also involves endoplasmic reticulum stress induction.

RIASSUNTO BREVE Il differenziamento epidermico prevede la migrazione dei cheratinociti dallo strato basale dell’epidermide a quelli sopra basali fino al raggiungimento dello strato più superficiale dove formano l’involucro corneo. Durante questo processo i futuri corneociti subiscono una serie di cambiamenti nella loro struttura e tali modifiche sono mediate dagli enzimi transglutaminasi. Le transglutaminasi (TGasi) rappresentano una famiglia di enzimi funzionalmente e strutturalmente correlati che catalizzano la reazione di trasferimento acilico Ca2+-dipendente tra il gruppo γ- carbossiamidico di residui di glutammina e il gruppo amminico di varie ammine primarie. In questo modo le transglutaminasi catalizzano la formazione di legami crociati (cross-linking) fra proteine che compongono l’involucro corneo. Quattro sono le TGasi espresse a livello epidermico (TGasi 1, TGasi 2, TGasi 3 e TGasi 5) e tutte, esclusa la TGasi 1, mostrano anche un’attività GTPasica. Nello strato basale dell’epidermide svolge invece una funzione molto importante il gene p63. Quest’ultimo è un membro della famiglia di p53, la cui trascrizione da due differenti promotori origina due diverse proteine:TAp63 che contiene un dominio di transattivazione all’N-terminale e ∆Np63che non lo possiede. Tale dominio è importante per l’attivazione dei geni bersaglio che presentano un motivo di legame per p63 di conseguenza TAp63 è considerato l’attivatore trascrizionale dei geni indotti durante il differenziamento, mentre l’espressione di ∆Np63 potrebbe essere correlata con il mantenimento dell’attività proliferante delle cellule staminali epidermiche localizzate nella membrana basale. Ognuna di queste due isoforme va inoltre incontro a splicing alternativo al C-terminale originando tre differenti varianti di splicing:α, β, γ. Topi p63-/- presentano severe anomalie nella pelle e negli arti. Lo scopo di questo progetto di ricerca è sia quello di fornire nuove conoscenze sul ruolo svolto dalla TGasi 3 durante il differenziamento epidermico che quello di individuare nuovi geni la cui attività risulta essere regolata da p63. Per quanto riguarda la TGasi 3 abbiamo deciso di realizzare topi knock-out condizionali attraverso l’utilizzo della ricombinasi Cre e dei siti loxP. Tale sistema consente infatti l’eliminazione tessuto-specifica dell’espressione del gene bersaglio. Durante gli esperimenti preliminari per la creazione di tali topi abbiamo inoltre scoperto due nuove varianti di splicing per il gene TGM3. La prima, denominata ∆6∆7, isolata nel topo manca della cisteina catalitica e sia l’attività di cross-linking che quella GTPasica risultano essere compromesse. La variante ∆9∆10, isolata nell’uomo, pur conservando intatta la triade catalitica presenta una bassa attività transamidasica, mentre l’attività GTPasica risulta essere persa. Nella seconda parte di questo lavoro di tesi abbiamo invece identificato un nuovo gene bersaglio denominato Scotin, la cui espressione risulta essere regolata positivamente in vitro dall’isoforma TA, ma non da ∆N. L’espressione di Scotin è localizzata nel reticolo endoplasmatico e nell’involucro nucleare. Questo gene è inoltre in grado di indurre apoptosi attraverso l’induzione di stress del reticolo endoplasmatico. Esperimenti condotti su colture epiteliali primarie (murine ed umane) hanno evidenziato come l’espressione di Scotin durante il differenziamento sia accompagnata, come atteso, dall’incremento dell’isoforma TA e dalla dimuzione di ∆N. In conclusione i nostri dati hanno portato all’isolamento di Scotin come nuovo gene bersaglio indotto da p63 durante il differenziamento epidermico. Tale meccanismo attiva la risposta allo “stress” da parte del reticolo endoplasmatico,di cui Scotin è un induttore, correlando così per la prima volta queste due differenti vie.