The role of Aip4/Itch, a member of Nedd4 family E3 ligases, in the ubiquitination of proteins involved in RTKs endocytosis

ABSTRACT We have used a recently developed genomic approach (WISE: Langraf et al.; 2004), to search the whole proteome for proteins containing peptides that could bind to the SH3 domains of amphiphysin I and endophilin, two proteins implicated in vesicle trafficking. Among the inferred candidate ligands we focused on the protein Itch, a HECT domain ubiquitin ligase that was recently shown to participate in ubiquitination processes affecting the internalization of the EGF receptor. Itch can be co-immunoprecipitated with Amphiphysin I, in vivo, suggesting that this interaction could promote the enzymatic activity of Itch in endocytic vesicles and endosome compartments. We are systematically testing a number of proteins involved in receptor endocytosis to see whether they are targets of the ubiquitination activity of Itch, in vivo or in vitro. We demonstrated that Itch is implicated in the binding and ubiquitination of three proteins HRS, STAM2, Eps15 that form a multivalent complex essential in sorting ubiquitinated

ABSTRACT E’ stata utilizzata una nuova tecnica di approccio genomico (WISE: Whole Interactome Scanning Experiment) per cercare, nell’intero proteoma umano, proteine contenenti peptidi in grado di interagire con i domini SH3 dell’anfifisina I e dell’endofilina, due proteine coinvolte nel traffico vescicolare. Dall’analisi dei risultati sono emersi degli interattori noti quali, la dinamina e la sinaptojanina e dei nuovi possibili interattori (Langraf et al.; 2004). Tra questi ultimi è stata focalizzata l’attenzione sulla proteina Aip4/Itch, una E3 ligasi appartenente alla famiglia di Nedd4, in quanto negli ultimi anni è stato dimostrato che l’ubiquitinazione ha un ruolo sempre più importante per la regolazione del traffico vescicolare. E’ stata confermato l’interazione interazione, in vitro, tra Itch e anfifisina, dimostrando che l’amfifisina I co-immunoprecipita con Itch, in vivo; tuutavia, nonostante il forte legame l’anfifisina non viene ubiquitinata da Itch. Questo fenomeno ha fatto supporre che il legame anfifisina-Itch possa promuovere la localizzazione e l’attività enzimatica di Itch a livello delle vescicole endocitiche e dei compartimenti endosomali. Alla luce di questa ipotesi sono state testate sistematicamente diverse proteine coinvolte nell’endocitosi dei recettori tirosin chinasici per verificare quali potevano essere bersaglio dell’attività ubiquitinante di Itch, sia in vivo che in vitro. Alla fine di questo lavoro di tesi è stato dimostrato che Itch è implicata nel legame e nell’ubiquitinazione di tre proteine: Hrs, STAM2 e Eps15. Queste tre proteine sono le costituenti di un etero-complesso multivalente essenziale per lo smistamento di proteine ubiquitinate nei diversi compartimenti vescicolari, in particolare sono implicate nel traffico vescicolare tra gli endosomi tardivi e i lisosomi.