Filogenesi molecolare, barcoding e stima dei tempi evolutivi in tre gruppi di farfalle diurne (insecta: lepidoptera) a distribuzione Sino-Himalayana

Transition zones are belts of biogeographical ambiguity where biotas evolved independently overlap and merge to various extents along relatively wide areas. The Sino-Himalayan transition zone is of special interest because it is characterised by the overlap between Palaearctic and Oriental biotas and by several taxa peculiar to this region. In this area the tectonic events originated by the collision between Indian and Euroasiatic plates during the Tertiary, have deeply influenced the evolution and distribution of plants and animals. Spectacular examples involve both plants and butterflies whose distribution seems to be a result of both dispersal and vicariant events, leading to repeated speciation and radiation processes resulting in several endemic taxa, typically occurring in the transition zone, and some speciose genera with extremely localized species. Nevertheless, in spite of the extraordinary scientific appeal, the knowledge about sino-himalayan fauna is still incomplete, because of both geomorphological and political impediments. In the present PhD thesis, I have studied three systematically different groups of Lepidoptera: i) all 14 known species belonging to the genus Byasa (family Papilionidae) with the addition of 4 species from the related genus Atrophaneura; ii) 31 out of 33 species within the genus Aporia (family Pieridae); iii) 13 species from the nicknamed “Callerebias” group (family Nymphalidae, subfamily Satyrinae), including four related genera Callerebia, Argestina, Hemadara, Loxerebia, 4 species from other two putatively allied genera Paralasa and Eugrumia, 8 species representing the Palaearctic genus Erebia, and 4 species of the tropical genus Yphtima. In order to investigate the evolutionary relationships within these three groups, a fragment of the mitochondrial gene COI has been sequenced for Byasa and Aporia samples, whereas the “Callerebias” group and allied genera have been investigated by means of sequences from both nuclear (EF-1α) and mithocondrial (COI and 16S) genes. Phylogenetic reconstructions, intra- and inter-specific divergence analyses, according to a DNA-barcode approach, estimates of divergence time for cladogenetic events (molecular clock approach) and speciation rates analyses (lineage through time plot) yielded interesting outcomes. Within Byasa group, the statistically well supported phylogeny reconstruction and the comparison between intra- and inter-specific genetic distances highlighted the high differentiation of the taxon B.latreillei genestieri from B.latreillei latreillei, suggesting the need to revise its taxonomic status (from subspecies to species), since these two taxa also differ in some morphological characters. The estimates of divergence time for cladogenetic events suggested that the ancestor of Byasa species occurred between 4.3 and 7.3 million years ago. Within the genus Aporia, the topology of the phylogenetic tree indicated some inconsistencies with the current classification, and suggested to revise place and status of some taxa, especially A.procris. Moreover, the comparison between genetic data and morphology of male genitalia underlined the irregular placement of A.lhamo. The estimates of divergence time for cladogenetic events suggested that the early diversification of Aporia took place about 6-10 million years ago. The comparison of the lineage through time analyses, performed independently for Byasa and Aporia groups, revealed remarkable similarities in patterns of speciation rates of the two groups. About 3.5 million years ago, the Sino-Himalayan region experienced a strengthening of the monsoon climate, concurrently the observed speciation rate trends for both groups appeared lower than expected. In both taxa speciation rates increased since 1.5 million years ago until present times. Apparently, due to glaciations, Sino-Himalayan species have been forced to change their geographic distribution according to local climate changes. These facts could explain the increase in the rate of speciation, promoted by the isolation of local populations into refugia ,and their subsequent divergence. The study of “Callerebias” was aimed to investigate two questions. The first was to ascertain their phylogenetic placement in respect of the genera Erebia and Ypthima, to determine whether Callerebias are still to be placed in the Ypthimina subtribe (as suggested by Miller’s classification) or in a different place. The second question was addressed to ascertain the geographic origin of this Sino-Himalayan group of butterflies. Besides phylogenetic inference, a dispersal and vicariance analysis (DIVA), has been used to solve this biogeographical question. The results were rather clear: Bayesian analysis returned a very strong topology, clustering Callerebias with Erebia, with Ypthima as outgroup. This result recommends a revision of the group and suggests a Palearctic origin for Callerebias. The analysis of dispersion and vicariance confirmed this hypothesis, placing the origin of Callerebie in the Eurasian Continent, about 5-7,5 Ma, as suggested by the molecular clock analysis.

Le zone di transizione sono regioni caratterizzate da ambiguità biogeografica dove biota differenti evolutisi indipendentemente si sovrappongono e si fondono in varia misura. La zona di transizione Sino-Himalayana è di particolare interesse perché è caratterizzata dalla sovrapposizione tra il biota Paleartico e quello Orientale e dalla presenza di taxa peculiari di questa stessa regione. In questa zona gli eventi tettonici conseguenti la collisione, avvenuta durante il Terziario, tra la placca Indiana ed Euroasiatica, hanno profondamente influenzato l'evoluzione e la distribuzione di piante ed animali. Esempi spettacolari si ritrovano tra le piante e le farfalle la cui distribuzione sembra essere conseguenza sia di eventi di dispersione che di vicarianza , con conseguenti ripetuti eventi di speciazione e fenomeni di radiazione adattativa che hanno portato alla formazione di numerosi taxa endemici, e di alcuni generi particolarmente speciosi con specie estremamente localizzate. Tuttavia, nonostante lo straordinario interesse scientifico che ricopre questa regione, la conoscenza della fauna Sino-Himalayana è ancora incompleta, per cause sia di natura geomorfologica che politica. Oggetto di studio della presente tesi di dottorato sono stati tre gruppi di Lepidotteri: i) genere Byasa (famiglia Papilionidae), per il quale sono state saggiate tutte le 14 specie conosciute con l'aggiunta di 4 specie del genere affine Atrophaneura, ii) genere Aporia (famiglia Pieridae) per il quale sono state saggiate 31 delle 33 specie conosciute; iii) un gruppo soprannominato Callerebie (famiglia Nymphalidae, sottofamiglia Satyrinae), comprendente 13 specie dei generi affini Callerebia, Argestina, Hemadara, Loxerebia, 4 specie appartenenti agli altri due generi affini Paralasa e Eugrumia, 8 specie del genere Paleartico Erebia, e 4 specie del genere tropicale Yphtima. Al fine di indagare le relazioni evolutive all'interno di questi tre gruppi, è stato sequenziato un frammento del gene mitocondriale COI per i campioni di Byasa e Aporia, mentre il gruppo Callerebie è stato indagato per mezzo di sequenze sia di derivazione nucleare (EF-1α) che mitocondriale (COI e 16S). Le analisi di ricostruzione filogenetica, il confronto delle distanze genetiche intra- e inter- specifiche, attuato secondo un approccio di DNA barcode, le stime del tempo di divergenza e degli eventi cladogenetici (approccio dell’orologio molecolare) e l’analisi dei tassi di speciazione (Lineage through time plot analysis) hanno prodotto risultati interessanti. All'interno del gruppo Byasa, è stata ottenuta una ricostruzione della filogenesi statisticamente ben supportata e il confronto tra distanze genetiche intra- ed inter-specifiche ha evidenziato l’elevata differenziazione del taxon B.latreillei genestieri da B.latreillei latreillei, suggerendo la necessità di rivalutare il suo status tassonomico (da sottospecie a specie), in quanto questi due taxa differiscono anche per alcuni caratteri morfologici ed ecologici. Le stime dei tempi di divergenza hanno suggerito che l'antenato delle diverse specie di Byasa risalga ad un periodo compreso tra 4,3 e 7,3 milioni di anni fa. All'interno del genere Aporia, la topologia dell'albero filogenetico ha indicato alcune incongruenze con l'attuale classificazione, e ha suggerito di rivedere posizione e status di alcuni taxa, soprattutto per la specie A.procris. Inoltre, il confronto tra i dati molecolari e la morfologia dei genitali maschili ha sottolineato la posizione irregolare di A.lhamo. Le stime del tempo di divergenza hanno suggerito che la diversificazione di Aporia abbia avuto luogo circa 6-10 milioni di anni fa. Il confronto tra le analisi di LTT plot, eseguito in modo indipendente per Byasa e Aporia, ha rivelato notevoli similitudini nell’andamento dei tassi di speciazione dei due gruppi. Circa 3,5 milioni di anni fa, , in concomitanza ad un rafforzamento del clima monsonico nella regione Sino-Himalayana, i tassi di speciazione per entrambi i gruppi risulta essere inferiore al previsto, per aumentare nuovamente intorno a 1,5 milione di anni fa mantenendo un andamento crescente fino ai giorni nostri. A quanto pare, a causa delle glaciazioni, le specie Sino-Himalayane sono state costrette a cambiare la loro distribuzione geografica in base ai cambiamenti del clima locale. Questi fatti potrebbero spiegare l'aumento del tasso di speciazione, promossa dal l'isolamento delle popolazioni locali in rifugi, e dalla loro successiva divergenza. Lo studio relativo alle Callerebie è stato diretto ad esaminare due differenti questioni. In primo luogo si è cercato di accertare la loro collocazione filogenetica nei confronti dei generi Erebia e Ypthima, per determinare se le Callerebie debbano ancora essere collocate nella sottotribù Ypthimina ,come suggerito dalla classificazione di Miller. In secondo luogo si è cercato di accertare l'origine geografica di questo gruppo di farfalle Sino-Himalayane . A tal fine all’analisi di ricostruzione filogenetica è stata affiancata l’analisi di dispersione e vicarianza (DIVA). I risultati ottenuti definiscono una situazione piuttosto chiara: l'analisi bayesiana ha restituito una topologia statisticamente ben supportata, raggruppando le Callerebie con Erebia, e collocando Ypthima come outgroup. Questo risultato propone una revisione del gruppo e suggerisce un’ origine paleartica per le Callerebie stesse. L'analisi di dispersione e vicarianza ha confermato questa ipotesi, ponendo l' origine delle Callerebie nel Continente euroasiatico, circa 5-7,5 Ma, come suggerito dall’orologio di analisi molecolare.