Adaptive immunity in a human chronic inflammatory disorder: phenotypic and functional characterization of T lymphocytes in a cohort of Chronic Granulomatous Disease patients

Chronic granulomatous disease (CGD) is a rare primary immunodeficiency syndrome characterized by mutations in one of the four genes that encode the subunits of NADPH oxidase, a enzyme principally involved in the ROS mediated pathogen killing. The patients are characterized by life-threatening and recurrent infections mainly by catalase-positive microorganisms, due to the inability of their phagocytes to express a respiratory burst against invading bacteria (e.g. Staphylococcus aureus) and fungi (e.g. Aspergillus fumigatus and Candida albicans). Patients, also suffer from a variety of sterile inflammatory conditions as acute and/or chronic inflammation with fibrosis containing non-caseous granulomas in the intestinal tract, liver, lymph nodes, urogenital tract, skin, and brain, most probably caused by an intrinsic dysregulation of the inflammatory mechanisms that can involve other cell types than the known defective phagocytes. Although in literature there are few immunological studies about cell function in CGD, a recent work on CGD animal model, has highlighted that in acute fungal infection, a dysregulation of IL-17-secreting cells, coupled with a decrease IFN-γ-producing effector cells and of IL-10-producing regulatory cells, could have a pathogenic role. Moreover, a decreased frequency of a specific T lymphocytes compartment, called Th17, for their characteristic IL-17A production, was associated with increased susceptibility to fungal end bacterial infection in several human chronic disease as hyper IgE syndrome (HIES) and chronic mucocutaneous candidiasis. In this study, we have investigated the potential involvement of T lymphocyte deregulation in CGD manifestations, by comparison of proliferation, mRNA expression, cytokine production and T lymphocyte phenotype upon fungal and bacterial antigen stimulation, of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) between a cohort of CGD patients and of healthy controls. Despite a very large variability in functional responses found in both patient and controls, we showed a statistical significant increased of proliferation upon C. albicans lysate and of IL-10 production upon A. fumigatus in CGD patients, coupled with a slight increase of IFN-γ and IL-17A upon fungal stimulation. Furthermore, upon A. fumigatus in the CDG cohort was found a statistically significant increased of IL-17A production, excluded one patient with chronic inflammation, and increased IL-17A mRNA expression, in agreement with an involvement of IL-17A+ cells in CGD pathogenesis, as shown by the CGD animal model of invasive aspergillosis. We also observed that, in agreement with a protective role of IFN-γ, CGD patients that experienced severe aspergillosis expressed low IFN-γ production compared with other patients, but similar to controls, while patient that not experienced severe aspergillosis had increased IFN-γ production compared to controls, demonstrating that a compensatory IFN-γ increased was need to protect patients with defect of ROS-mediated killing. Concerning the responses to C. albicans yeast and hyphae stimulation, we observed similar amount of IFN-γ and increased of IL-17A and IL-10 levels, compared to controls, showing that probably different pathological mechanism lead to increased Candida albicans infections in CGD with respect to HIES, because it would not be dependent on a decrease of IL17A response to fungal antigens. Moreover, in comparison to CGD patients, HIES patients expressed lower value of IFN-γ for all antigens, but differently to STAT3-mutated HIES patient, that not express IL-17A upon all kinds of stimulation, in STAT3-wt HIES patient IL-17A production upon both C. albicans yeast and hyphae was similar to CGD and increased compared to age-matched healthy controls. Thus the reduced frequencies of C. albicans infection in CGD compared to STAT3-wt HIES, may be explained through the main protective level of IFN-γ. Moreover we believe that in vitro immunological test can help us to exclude a STAT3 mutation, in patients who have a positive score for HIES, before performing a molecular analysis of the gene.

La malattia granulomatosa cronica è una rara immunodeficienza primitiva, dovuta a mutazioni di uno dei quattro geni che codificano per le componenti catalitiche e regolatorie della NADPH ossidasi, un enzima coinvolto nella produzione dei ROS, necessari per mediare l’uccisione del patogeno fagocitato da neutrofili, monociti e macrofagi. I pazienti sono quindi caratterizzati dall’avere un’aumentata suscettibilità ad infezioni dovute a microrganismi catalasi-positivi come batteri (es. Staphylococcus aureus) e funghi (es. Aspergillus fumigatus e Candida albicans). Inoltre, i pazienti soffrono di infiammazioni acute e croniche, con fibrosi e formazione di lesioni granulomatose in vari organi quali fegato, pelle, tratto digerente e urogenitale, linfonodi e nei casi più gravi cervello. Questi danni cronici, non direttamente riconducibili ad infezioni microbiche, sono probabilmente causati da alterazioni delle risposte immunitarie che coinvolgono anche altre cellule diverse dai fagociti. Ci sono pochi studi immunologici sui linfociti nei pazienti affetti da CGD, ma un recente lavoro condotto sul modello murino di CGD con aspergillosi invasiva, ha mostrato che nella fase acuta dell’infezione, i linfociti produttori di IL-17A vanno incontro ad una espansione incontrollata, con una ridotto numero di cellule effettrici IFN-γ +e di cellule regolatorie IL-10+. Inoltre la diminuita frequenza di linfociti Th17, produttrici di IL-17 è stata associata con l’aumento di infezioni batteriche e di Candida in due malattie croniche come la sindrome da iper IgE (HIES) e la candidiasi mucocutanea cronica. In questo studio abbiamo investigato il potenziale coinvolgimento dei linfociti T nella patogenesi della CGD, comparando: test di linfoproliferazione, quantificazione dell’espressione del mRNA e della produzione delle citochine, e l’analisi del fenotipo linfocitario, tra pazienti e controlli sani. Nonostante la grande variabilità nella risposta tra tutti i soggetti analizzati, i pazienti hanno mostrato un significativo aumento di proliferazione indotta dal lisato di C. albicans e un significativo aumento nella produzione di IL-10 con stimolazione da parte d A. fumigatus, ma anche un lieve aumento di produzione di IFN-γ e IL-17A dopo stimolazione con antigeni fungini, rispetto alla popolazione di controllo. L’ aumentata produzione di IL-17A diventava significativa quando dalla corte dei pazienti si escludeva un paziente particolare, che aveva un’infiammazione cronica intestinale. Anche l’espressione del mRNA per l’IL-17A è stata trovata aumentata nei PBMC non stimolati dei pazienti, rispetto ai controlli, indicando un possibile coinvolgimento di questa citochina nella patogenesi della CGD come mostrato nel modello animale. Inoltre, in accordo con il suo ruolo protettivo nell’infezione da A. fumigatus, la produzione di IFN-γ indotta dal fungo, era ridotta nei pazienti che avevano subito un’aspergillosi, rispetto agli altri CGD, ma simile rispetto ai controlli, mentre i pazienti che non avevano avuto aspergillosi, producevano livelli più elevati d’IFN-γ rispetto ai controlli, indicando che un aumentato livello d’IFN-γ è probabilmente richiesto per compensare la ridotta degradazione del fungo presente nei pazienti con CGD. Rispetto ai controlli, i PBMC dei pazienti stimolati con lieviti e ife di C. albicans, producevano livelli simili d’IFN-γ, ma aumentati livelli di IL-17A e IL-10, indicando che l’aumentata frequenza alle infezioni di Candida nei CGD forse richiede un meccanismo diverso rispetto alla HIES , che non dipende dalla diminuita frequenza di linfociti Th17. I PBMC dei due pazienti con HIES, rispetto a quelli dei CGD, producevano livelli più bassi d’IFN-γ dopo stimolo con tutti gli antigeni. Per quanto riguarda l’IL-17A, diversamente dal paziente HIES con mutazione di STAT3 che non produceva affatto, il paziente HIES senza mutazione, dopo stimolazione con lieviti e ife di C. albicans produceva livelli di IL-17A simili a quelli trovati per i pazienti CGD e maggiori rispetto a quelli dei controlli. Quindi è plausibile che la ridotta frequenza d’infezioni da Candida nei pazienti CGD, rispetto ai pazienti HIES, sia dovuta alla maggior protezione mediata da più alti livelli d’IFN-γ. Inoltre, poiché i pazienti HIES con mutazione STAT3 non producono IL-17A, noi pensiamo che l’utilizzo di test immunologici in vitro, possa servire a meglio indirizzare le future indagini molecolari nei pazienti con sospetta HIES.