Modulazione dell'espressione di BDNF nella linea cellulare umana di glioblastoma da parte della paroxetina

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is the most widely expressed neurotrophin in the mammalian nervous system. It has been widely studied, like other neurotrophins such as nerve growth factor, because it is in close relationship with neuronal development and plasticity, in particular with long-lasting changes in synaptic relations and morphology. During development BDNF supports the survival and the differentiation of neuronal populations of the peripheral and central nervous systems and takes part in axonal growth and, also acting as a central modulator of pain. The role of this protein in synaptic plasticity has been linked to the observation of a reciprocal regulation between BDNF expression and synaptic activity. The human BDNF gene spans ~70 kb within the 11p14 chromosome. It displays a great complexity due to alternative promoters usage, alternative splicing mechanisms and the presence of alternative polyadenylation sites. Concerning its expression, BDNF displays a widespread distribution pattern in the nervous systems of adults, with the highest levels of mRNA and protein in the hippocampus, amygdala, cerebral cortex and hypothalamus. Recent studies have suggested that BDNF is involved in a number of traits and human disorders. In fact it has been associated with differences in performance of intelligence tests and other cognitive functions, influencing personality and memory and being related to neurodegenerative diseases such as, Alzheimer’s disease, bipolar disorders and depression. In particular, many studies have highlighted a tight connection between BDNF levels and depression, suggesting that this disease could be caused by a decrease of the protein in the brain. It has been noticed that negative effects on mood could be lowered by inhibiting the reuptake of neurotransmitters, such as serotonin, that are able to increase the expression of BDNF. In fact, the inhibition of reuptake from axons causes these molecules to accumulate into the synaptic space thus having more time to act on neurons and glial cells. The SSRIs (selective serotonin reuptake inhibitors) selectively and powerfully inhibit serotonin reuptake resulting in a potentiation of serotonergic neurotransmission. However, the efficacy of these antidepressants cannot be only explained by their actions on the monoaminergic system and hence the mechanism of action of antidepressant drugs remain largely unknown, in particular the molecular and cellular adaptations that underlie the therapeutic action of these drugs. It has been found that antidepressants are also able to act on glial cells in rat models and it is possible that a reduction of these cells and their neuron-supporting action is involved in the pathophysiology of different psychiatric deseases. To investigate the effects of paroxetine on BDNF expression and on the release of protein in non-neural cells, we used a human glioblastoma-astrocytoma cell line, U-87 MG. Cultured cells were treated with the antidepressant at the final concentration of 7 µM for different time lengths (6, 12, 24, 48 hours). Expression of BDNF mRNA and miR-30-5p were analyzed by reverse transcription Real-Time PCR. We also studied BDNF concentration in the cultured cells and the medium through Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, in order to detect protein synthesis and release induced by treatment. We observed that BDNF mRNA expression was significantly increased in the first 6 hours of paroxetine treatment with respect to non treated cells. In treated cells, this overexpression led to an increase in protein production after 12 hours of incubation and, in particular, in the release of BDNF protein in the culture medium already after 24 hours, while in non treated cells we observed BDNF protein in medium only after 48 hours. miR expression reaches a peak at 12 hours. Our results suggested that paroxetine treatment in this non-neuronal cell line increases BDNF expression, resulting in greater protein synthesis and release. These cells are not able to produce serotonin or other neurotransmitters because they are non-neuronal cells. Paroxentine seems to affect these non-neuronal cells in a similar manner to neuronal cells, but one would suspect that the effect occurs via an alternative pathway, independent from the neuronal monoaminergic system. The enhanced and prolonged induction of BDNF by antidepressants could promote neuronal survival, and protect neurons, such as glial cells, from the damaging effects of stress. This could contribute to explain therapeutic action of antidepressants suggesting new strategies of pharmacological intervention.

Brain-derived Neurotrophic factor (BDNF) è la neurotrofina più espressa nel sistema nervoso dei mammiferi. Esso è stato estesamente studiato, così come altre neurotrofine come il Fattore di Crescita del Nervo (NGF), poiché è in stretta relazione con lo sviluppo neuronale e la sua plasticità, in particolar modo nei cambiamenti a lungo termine e nella sua morfologia. Durante lo sviluppo BDNF supporta la sopravvivenza ed il differenziamento delle popolazioni neuronali del sistema nervoso centrale e periferico ed inoltre prende parte alla crescita ed alla morfologia assonale, agendo anche come modulatore del dolore. Il ruolo di questa proteina nella plasticità sinaptica è stata collegata all’osservazione di una regolazione reciproca tra la sua espressione e la plasticità sinaptica. Il gene BDNF si estende per circa 70 kb all’interno del cromosoma 11p4. Esso mostra una grande complessità a causa dell’uso di promotori alternativi, di meccanismi di splicing alternativo e della presenza di siti di poliadenilazione. Per quanto riguarda la sua espressione, BDNF mostra una diffusa presenza nel sistema nervoso degli adulti, con il più alto livello di mRNA e proteina nell’ippocampo, amigdala, corteccia cerebrale e ipotalamo. Studi recenti hanno suggerito che BDNF è coinvolto in un ampio numero di malattie nell’uomo. Infatti è stato associato a differenze nell’esito di test di intelligenza ed altre funzioni cognitive, influenzando la personalità e la memoria ed essendo relazionabile a malattie neurodegenerative come la schizofrenia, l’Alzheimer, disordini bipolari e depressione. In particolare, diversi studi hanno evidenziato una stretta correlazione tra i livelli di BDNF e la depressione, suggerendo che questa malattia potrebbe essere causata da una diminuzione dei livelli di questa proteina nel cervello. È stato anche notato che gli effetti negativi sull’umore potrebbero essere contrastati inibendo il riassorbimento dei neurotrasmettitori come la serotonina, che sono capaci di aumentare l’espressione di BDNF. Infatti l’inibizione del loro riassorbimento dagli assoni provocano l’accumulo di queste molecole nello spazio sinaptico, avendo così più tempo di agire sui neuroni e sulle cellule gliali. Gli SSRI (Selective-Serotonine Reuptake Inhibitors) inibiscono selettivamente ed estesamente il riassorbimento della serotonina, determinando un incremento della neurotrasmissione serotonergica. Comunque, l’efficacia di questi antidepressivi non può essere solamente spiegata tramite la loro azione sul sistema monoaminergico, perciò il motivo di azione dei farmaci antidepressivi rimane largamente sconosciuto, in particolar modo gli adattamenti molecolari e cellulari che giustificano la loro azione terapeutica. È stato scoperto che gli antidepressivi sono anche capaci di agire sulle cellule gliali di ratto ed è possibile che una riduzione di queste cellule e della loro azione di supporto ai neuroni è coinvolta nella fisiopatologia di differenti malattie psichiatriche. Per investigare gli effetti della paroxetina sull’espressione di BDNF e sul rilascio di questa proteina da parte di cellule non neuronali, sono state usate linee cellulari di glioblastoma-astrocitoma, U-87 MG. Esse sono state trattate con paroxetina ad una concentrazione di 7 μM per differenti intervalli di tempo (6, 12, 24, 48 ore). L’espressione dell’mRNA e del miR-30a-5p è stata analizzata attraverso una retrotrascrizione e una PCR Real Time. È stata anche studiata la concentrazione di BDNF nelle cellule e nel terreno di crescita attraverso un saggio ELISA, per determinare la sintesi della proteina ed il suo rilascio a seguito del trattamento con paroxetina. È stato osservato che l’espressione dell’mRNA di BDNF è significativamente aumentata durante le prime 6 ore di trattamento con paroxetina rispetto alle cellule non trattate. Nelle cellule trattate questa overespressione conduce ad un picco di produzione a 12 ore di incubazione ed, in particolare, nella sua secrezione nel mezzo cellulare dopo 24 ore, mentre nelle cellule non trattate questo rilascio è stato notato solo dopo 48 ore. L’espressione del miR-30a-5p, che controlla la traduzione di BDNF, raggiunge un picco a 12 ore. Questi risultati conducono all’ipotesi che il trattamento di questa linea cellulare non neuronale con paroxetina aumenta l’espressione di BDNF, manifestatasi in una maggiore sintesi e rilascio di proteina. Queste cellule non sono capaci di produrre serotonina o altri neurotrasmettitori poichè esse sono cellule non neuronali. La paroxetina sembra agire su queste cellule in modo simile ai neuroni, per questo si potrebbe supporre che tale effetto sia dovuto all’utilizzo di una via alternativa indipendente dal sistema neuronale monoaminergico. L’aumentata e prolungata induzione di BDNF attraverso gli antidepressivi potrebbe promuovere la sopravvivenza neuronale e proteggere i neuroni, così come le cellule della glia, dagli effetti dannosi dello stress. Ciò potrebbe contribuire a spiegare l’azione terapeutica degli antidepressivi suggerendo nuove strategie per l’intervento farmacologico.