Il microRNA-101 regola la proteina precursore del peptide β-amiloide

In the pathogenesis of Alzheimer's disease, the expression level of the β-amyloid precursor protein (APP) plays a crucial role. It has been shown that mutations which increase APP protein synthesis, including the duplication of the locus of APP gene in certain families and trisomy of chromosome 21 (containing the APP gene), are sufficient to induce the early form of pathology. Therefore APP gene regulation has been extensively studied and both the promoter and 5’ and 3’ untranslated regions of mRNA have been charachterised. In recent years, the post-transcriptional mechanism of gene expression mediated by microRNAs has been discovered and investigated in several biological mechanisms and cell types. MicroRNAs have been shown to finely modulate the translation of proteins needed for the response to extracellular stimuli, and to define the spatial and temporal expression profiles of genes involved in neuronal development and differentiation. This experimental thesis focused on the question whether microRNAs are significantly involved in APP regulation. Through RNAi , Argonauta-2 gene, a key component of the ribonucleoprotein complex mediating the action of microRNAs, was silenced and APP protein increase was observed. Through bioinformatic analysis, microRNAs potentially interacting with APP have been identified and miR-101, which is enriched in the nervous system, was further investigated. Through expression analysis in rat hippocampus, from 8 days up to 6 months of age, it was observed an inverse correlation between miR-101 levels, which increase, and APP expression, which decreases over time. Using a reporter construct, the ability of miR-101 to inhibit the translation of APP through direct interaction with the messenger 3’UTR was demonstrated. Through inhibition of miR-101 in hippocampal primary cultures, a significant increase of endogenous APP protein was observed, confirming the miRNA regulatory function in the neuronal context. Instead miR-101 over-expression was effective in inducing APP repression at post-transcriptional level. It was also observed that stimulation of hippocampal neurons with IL-1, the first player of neuroinflammation and risk factor for Alzheimers Disease, induces coordinated modulation of APP and miR-101. These data demonstrate the repressive effect of miR-101 on APP under physiological conditions, while the alteration of this regulation is sufficient to induce an increase of APP protein, a condition which is associated to familial Alzheimer’s disease. In view of previous studies, in which miR-101 was shown to be down-regulated in the brains of sporadic cases of Alzheimer's disease, and of data obtained in this work, miR-101 may be a protective regulator of excessive production of β-amyloid precursor protein. The characterization of the signal transduction pathway activated by neuroinflammation, involving miR-101, and the relationship between this pathway and Alzheimer's disease might open a new perspective on the pathogenesis of this neurodegenerative disease.

Nella patogenesi della malattia di Alzheimer, il livello di espressione della proteina precursore del peptide β-amiloide (APP) riveste un ruolo determinante. E’ stato evidenziato che mutazioni che incrementano la sintesi proteica di APP, inclusa la duplicazione genica del locus di APP in alcune famiglie e nella trisomia del cromosoma 21, che contiene il gene APP, sono sufficienti per indurre lo sviluppo della patologia in forma precoce. Per questo motivo, la regolazione del gene APP è stata oggetto di intensi studi riguardanti sia la caratterizzazione del promotore, che le regioni 5’ e 3’ non tradotte dell’RNA messaggero. Negli ultimi anni, il meccanismo di regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica mediato dai microRNA è stato estesamente indagato in diversi meccanismi biologici e in vari tipi cellulari. I microRNA modulano finemente la traduzione di proteine necessarie alla risposta a stimoli di origine extracellulare, ed in altri casi definiscono spazialmente e temporalmente i profili di espressione di geni coinvolti nello sviluppo e differenziamento. Lo svolgimento di questa tesi sperimentale ha trovato il suo avvio nella domanda se il sistema dei microRNA fosse coinvolto in maniera significativa nella regolazione dell’espressione dell’APP. Tramite RNAi, è stata silenziato il gene Argonauta 2, componente fondamentale del complesso ribonucleoproteico che media l’azione dei microRNA, ed è stato osservato un aumento della proteina APP. Mediante analisi bioinformatica sono stati individuati i possibili microRNA interagenti con APP ed è stato scelto il miR-101, arricchito nel sistema nervoso. Tramite analisi dei profili di espressione in ippocampo di ratto, tra gli 8 giorni e i 6 mesi di età, è stata osservata una correlazione inversa tra i livelli di miR-101, che aumenta, e APP, che diminuisce nel corso del tempo. Utilizzando un costrutto reporter, è stata dimostrata la capacità del miR-101 di inibire la traduzione di APP attraverso l’interazione diretta con il 3’UTR del messaggero. Bloccando l’azione del miR-101 in colture primarie ippocampali, è stato osservato un significativo aumento della proteina APP endogena, confermando l’azione regolatoria del microRNA nel contesto neuronale fisiologico, mentre la over-espressione del miR-101 si è rivelata efficace nell’indurre una repressione a livello post-trascrizionale dell’APP. E’ stato inoltre osservato che la stimolazione di neuroni ippocampali con Interleuchina-1β, principale mediatore della neuroinfiammazione e fattore di rischio per AD, induce una modulazione coordinata nel tempo di APP e del miR-101. I dati ottenuti dimostrano quindi l’esistenza di un’attività repressiva del miR-101 sull’APP in condizioni fisiologiche, mentre la perturbazione di tale regolazione è sufficiente ad indurre un aumento della proteina APP, condizione associata alla patologia di Alzheimer. Considerando studi recenti, in cui il miR-101 è stato visto down-regolato in cervelli di casi sporadici di malattia di Alzheimer, e i dati qui ottenuti, miR-101 può essere visto come un regolatore con attività protettiva verso una eccessiva produzione del precursore del peptide β-amiloide. La caratterizzazione della via di trasduzione del segnale, neuroinfiammatorio, che coinvolge il miR-101, e la sua possibile associazione con la patologia di Alzheimer potrebbero aprire nuovi scenari nella eziopatogenesi di questa malattia neurodegenerativa.