Ribosomal biogenesis is important for cell growth and proliferation. Perturbation of the synthesis and assembly of ribosomal components, as for instance inhibition of rRNA synthesis or decrease of ribosomal protein (RP) production, may lead to nucleolar disruption and to release and/or degradation of ribosomal component. In the last years, several studies suggested that p53 is activated in response to such a “ribosomal stress”, leading to growth arrest or apoptosis.Alteration of ribosome synthesis or function is implicated in several diseases, in which mutation in the genes coding for RP or other nucleolar components may cause defect in ribosome biogenesis. We have been studying the molecular mechanisms of Diamond-BlackfanAnemia (DBA), a congenital hypo plastic anemia associated to various physical malformations. Mutations in rpS19 gene have been identified in about 25% of patients whereas another 2% have mutations in the rpS24 gene. A decrease in RPS19 and RPS24 level has been shown to cause a defect in the maturation of 18S ribosomal RNA. While the role of RPS19 mutations results well investigated and characterized, less clear is the effect of specific alterations in other RPs such as RPS24 or RPS7. Recently two new mutations of rpS24 gene: a substitution and a deletion, are emerged from a study on DBA patients in Italy and one mutation has been found in a mouse model from a laboratory studying neuronal diseases. With the aim of analyzing the functional features of these new mutated RPS24, we prepared cDNA constructs. After transfection we analyzed the stability and the ability of exogenous mutated proteins to be assembled into mature ribosomes. Our results indicate that some RPS24 and RPS7 mutations are very unstable when compared with WT proteins. Yet, once stabilized, allelic variants analyzed in this study, even mutated, are able to be assembled into mature ribosome. In the last part of the project, we have studied erythroleukemia cell lines, TF-1C and myelogenous leukemia K562C, infected with a lentiviral vector inducible for the expression of siRNA specific for RPS19 mRNA. Parental cell lines present a fundamental difference: TF-1 express a wild type p53 whereas K562 do not show detectable levels of p53. In these cells we monitored the effect of ribosome alteration on the expression of selected proteins and on cell growth parameters. One of the proteins that we found affected by ribosome alteration is the oncogenic serine/threonine kinase PIM1, highly expressed in cells of hematopoietic origin.

La biogenesi del ribosoma è importante per la crescita e la proliferazione cellulare. La perturbazione della sintesi e dell’assemblaggio di componenti ribosomali, come ad esempio l'inibizione della sintesi di rRNA o la diminuita produzione di una proteina ribosomale (RP), possono alterare l’equilibrio del nucleolo e causare il rilascio e addiruttura la degradazione della componente ribosomale. Negli ultimi anni, diversi studi propongono l’oncosoppressore p53 quale possibile effettore di uno stato di stress "ribosomiale", con conseguente arresto della crescita e apoptosi. L’alterazione della sintesi dei ribosomi o della loro funzione è alla base dell’eziogenesi di diverse sindromi nell’uomo. Nel nostro laboratorio abbiamo studiato i meccanismi molecolari dell’anemia di Diamond-Blackfan (DBA), patologia congenita associata a varie malformazioni fisiche. Mutazioni nel gene rpS19 sono state individuate in circa il 25% dei pazienti affetti da DBA, un altro 2% presenta mutazioni nel gene rpS24. La diminuzione dei livelli di proteine RPS19 e RPS24 è stata correlata con difetti nella maturazione dell’ RNA ribosomale 18S in diversi modelli sperimentali. Mentre il ruolo dell’effetto delle mutazioni nel gene rpS19 risulta ben studiato e caratterizzato, meno chiaro è l'effetto di alterazioni specifiche in altre proteine ribosomali come RPS24 o RPS7. Recentemente due nuove mutazioni del gene rpS24: una sostituzione e una delezione, sono emerse nell’ambito di uno studio su pazienti DBA in Italia, mentre una sostituzione nel gene rpS7 è stata identificata nel modello murino di alcuni studi su disturbi neuronali. Con l'obiettivo di analizzare le caratteristiche funzionali di queste nuove mutazioni, ci siamo serviti di costrutti cDNA. Dopo la trasfezione abbiamo analizzato le proteine mutanti esogene per la loro stabilità e capacità di essere assemblate in ribosomi maturi. I nostri risultati indicano che i prodotti delle varianti alleliche rpS24 e rpS7 sono molto instabili se confrontate con le proteine WT. Tuttavia, una volta stabilizzate, benchè mutate, queste proteine sono in grado di essere assemblate in ribosomi maturi. Nell'ultima parte del progetto, abbiamo studiato linee di eritroleucemia umana (TF-1C) e di leucemia mieloide (K562C), infettate da vettori lentivirali inducibili per l'espressione di specifici siRNA per l’mRNA RPS19. Le linee parentali delle colture cellulari da noi analizzate, presentano una differenza fondamentale: le colture TF1 esprimono p53 wild type, mentre la linea K562 non mostra livelli rilevabili di p53. In queste cellule abbiamo monitorato l'effetto di alterazione sul ribosoma, sull'espressione di proteine selezionate e sui parametri di crescita delle cellule. Una delle proteine che risultano influenzate dall’ alterazione del ribosoma è la serin/treonin chinasi PIM1, altamente espressa in cellule di origine ematopoietica.

Biondini, L. (2010). Effect of qualitative and quantitative alteration of ribosomal proteins on ribosome synthesis and cell metabolism.

Effect of qualitative and quantitative alteration of ribosomal proteins on ribosome synthesis and cell metabolism

BIONDINI, LAURA
2010-01-13

Abstract

Ribosomal biogenesis is important for cell growth and proliferation. Perturbation of the synthesis and assembly of ribosomal components, as for instance inhibition of rRNA synthesis or decrease of ribosomal protein (RP) production, may lead to nucleolar disruption and to release and/or degradation of ribosomal component. In the last years, several studies suggested that p53 is activated in response to such a “ribosomal stress”, leading to growth arrest or apoptosis.Alteration of ribosome synthesis or function is implicated in several diseases, in which mutation in the genes coding for RP or other nucleolar components may cause defect in ribosome biogenesis. We have been studying the molecular mechanisms of Diamond-BlackfanAnemia (DBA), a congenital hypo plastic anemia associated to various physical malformations. Mutations in rpS19 gene have been identified in about 25% of patients whereas another 2% have mutations in the rpS24 gene. A decrease in RPS19 and RPS24 level has been shown to cause a defect in the maturation of 18S ribosomal RNA. While the role of RPS19 mutations results well investigated and characterized, less clear is the effect of specific alterations in other RPs such as RPS24 or RPS7. Recently two new mutations of rpS24 gene: a substitution and a deletion, are emerged from a study on DBA patients in Italy and one mutation has been found in a mouse model from a laboratory studying neuronal diseases. With the aim of analyzing the functional features of these new mutated RPS24, we prepared cDNA constructs. After transfection we analyzed the stability and the ability of exogenous mutated proteins to be assembled into mature ribosomes. Our results indicate that some RPS24 and RPS7 mutations are very unstable when compared with WT proteins. Yet, once stabilized, allelic variants analyzed in this study, even mutated, are able to be assembled into mature ribosome. In the last part of the project, we have studied erythroleukemia cell lines, TF-1C and myelogenous leukemia K562C, infected with a lentiviral vector inducible for the expression of siRNA specific for RPS19 mRNA. Parental cell lines present a fundamental difference: TF-1 express a wild type p53 whereas K562 do not show detectable levels of p53. In these cells we monitored the effect of ribosome alteration on the expression of selected proteins and on cell growth parameters. One of the proteins that we found affected by ribosome alteration is the oncogenic serine/threonine kinase PIM1, highly expressed in cells of hematopoietic origin.
13-gen-2010
A.A. 2009/2010
Biologia molecolare e cellulare
22.
La biogenesi del ribosoma è importante per la crescita e la proliferazione cellulare. La perturbazione della sintesi e dell’assemblaggio di componenti ribosomali, come ad esempio l'inibizione della sintesi di rRNA o la diminuita produzione di una proteina ribosomale (RP), possono alterare l’equilibrio del nucleolo e causare il rilascio e addiruttura la degradazione della componente ribosomale. Negli ultimi anni, diversi studi propongono l’oncosoppressore p53 quale possibile effettore di uno stato di stress "ribosomiale", con conseguente arresto della crescita e apoptosi. L’alterazione della sintesi dei ribosomi o della loro funzione è alla base dell’eziogenesi di diverse sindromi nell’uomo. Nel nostro laboratorio abbiamo studiato i meccanismi molecolari dell’anemia di Diamond-Blackfan (DBA), patologia congenita associata a varie malformazioni fisiche. Mutazioni nel gene rpS19 sono state individuate in circa il 25% dei pazienti affetti da DBA, un altro 2% presenta mutazioni nel gene rpS24. La diminuzione dei livelli di proteine RPS19 e RPS24 è stata correlata con difetti nella maturazione dell’ RNA ribosomale 18S in diversi modelli sperimentali. Mentre il ruolo dell’effetto delle mutazioni nel gene rpS19 risulta ben studiato e caratterizzato, meno chiaro è l'effetto di alterazioni specifiche in altre proteine ribosomali come RPS24 o RPS7. Recentemente due nuove mutazioni del gene rpS24: una sostituzione e una delezione, sono emerse nell’ambito di uno studio su pazienti DBA in Italia, mentre una sostituzione nel gene rpS7 è stata identificata nel modello murino di alcuni studi su disturbi neuronali. Con l'obiettivo di analizzare le caratteristiche funzionali di queste nuove mutazioni, ci siamo serviti di costrutti cDNA. Dopo la trasfezione abbiamo analizzato le proteine mutanti esogene per la loro stabilità e capacità di essere assemblate in ribosomi maturi. I nostri risultati indicano che i prodotti delle varianti alleliche rpS24 e rpS7 sono molto instabili se confrontate con le proteine WT. Tuttavia, una volta stabilizzate, benchè mutate, queste proteine sono in grado di essere assemblate in ribosomi maturi. Nell'ultima parte del progetto, abbiamo studiato linee di eritroleucemia umana (TF-1C) e di leucemia mieloide (K562C), infettate da vettori lentivirali inducibili per l'espressione di specifici siRNA per l’mRNA RPS19. Le linee parentali delle colture cellulari da noi analizzate, presentano una differenza fondamentale: le colture TF1 esprimono p53 wild type, mentre la linea K562 non mostra livelli rilevabili di p53. In queste cellule abbiamo monitorato l'effetto di alterazione sul ribosoma, sull'espressione di proteine selezionate e sui parametri di crescita delle cellule. Una delle proteine che risultano influenzate dall’ alterazione del ribosoma è la serin/treonin chinasi PIM1, altamente espressa in cellule di origine ematopoietica.
ribosomal protein; ribosomal stress; diamond-blackfan anemia; ribosomal biogenesis; rRNA processing
Settore BIO/11 - BIOLOGIA MOLECOLARE
English
Tesi di dottorato
Biondini, L. (2010). Effect of qualitative and quantitative alteration of ribosomal proteins on ribosome synthesis and cell metabolism.
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