Molecular characterization and novel mutations in a large cohort of patients with chronic granulomatous disease

Background: Chronic Granulomatous Disease (CGD;MIM#306400) is a rare primary immunodeficiency affecting the innate immune system. The disease is characterized by a greatly increased susceptibility to severe fungal and bacterial infections. CGD is caused by mutations in any one of four genes encoding subunits of the superoxide-generating phagocyte NADPH-oxidase, resulting in an absence or very low levels of enzyme activity. Aim: this study represents the first molecular characterization of a large cohort of italian patients affected by CGD. Its aim was to definetely define the type of molecular lesion in our patients, an indispensable tool for genetic counseling and prenatal diagnosis of CGD. This study focused the great genetic and clinical heterogeneity of the disease and the notion that genetic analysis is a critical step in obtaining a definitive diagnosis of CGD. Materials and Methods: the molecular study was performed essentially by DHPLC, to screen the presence of the different mutations and by sequencing of the suspected exons identified by DHPLC. This approch was extremely productive in terms of time and sensitivity. Functional tests were also performed to identify the level of protein expression and activity. Results: I reported the results of CYBB (encoding the gp91phox subunit) and NCF-1 (encoding the p47phox subunit) gene sequence analysis in 34 CGD patients from 29 unrelated families and their relatives. This report described nine novel CYBB mutations and their consequences. The carrier analysis was performed in 23 patients’ mothers and 16 female relatives through molecular and FISH studies. Conclusions: the molecular analysis performed in our cohort of CGD patients, underlines the breadth and the heterogeneity of the mutations responsible for the disease. It is likely that other factors may affect the clinical severity of CGD such as polymorphisms in oxygen-independent antimicrobial systems or other components of the immune system. Moreover, systematic characterization of molecular defect and polymorphisms in larger cohorts of patients, might help us to better relate clinical form and functional data to the type of the mutation found.

Background: La malattia Granulomatosa Cronica (CGD; MIM#306400) è una rara immunodeficienza primitiva che colpisce il sistema dell’immunità innata. La malattia è caratterizzata da un aumento sostanziale della suscettibilità a infezioni gravi sia batteriche che fungine. La malattia granulomatosa è causata da mutazioni nei geni che codificano le subunità della NADPH ossidasi dei fagociti, responsabile della produzione di superossido, tali mutazioni determinano l’assenza o bassi livelli di espressione dell’enzima NADPH ossidasi. Scopo: questo studio rappresenta la prima caratterizzazione molecolare di una coorte estesa di pazienti italiani affetti da malattia granulomatosa cronica. Lo scopo è stato quello di definire precisamente il difetto molecolare presente nei nostri pazienti, un dato essenziale nel counseling genetico e nella diagnosi prenatale. Lo studio ha messo a fuoco inoltre, la grande eterogeneità genetica e fenotipica della malattia e ha ribadito l’importanza dell’analisi genetica come step critico nell’ottenere una diagnosi definitiva di malattia granulomatosa cronica. Materiali e Metodi: lo studio molecolare è stato condotto principalmente mediante DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography), un sistema cromatografico che permette la localizzazione delle mutazioni e mediante sequenziamento diretto degli esoni individuati attraverso l’analisi per DHPLC. Questa strategia si è rivelata estremamente produttiva in termini di tempo e sensibilità permettendo l’individuazione del 100% delle mutazioni attese e diversi polimorfismi. Test funzionali sono stati condotti inoltre, per stabilire l’espressione e l’attività della proteina mutata. Risultati: sono riportati i dati del sequenziamento dei geni CYBB e NCF-1, che codificano rispettivamente le subunità gp91phox e p47phox della NADPH ossidasi, in 34 pazienti affetti da CGD provenienti da 29 famiglie differenti e dei loro parenti. Sono riportate 9 mutazioni nuove nel gene CYBB e le loro conseguenze. L’analisi per stabilire lo stato di portatore è stata condotta in 16 femmine delle famiglie affette attraverso studi molecolari e mediante FISH. Conclusioni: l’analisi molecolare dei nostri pazienti affetti da CGD ha sottolineato l’ampiezza e l’eterogeneità dello spettro di mutazioni responsabili della malattia. E’ probabile che altri fattori possano influenzare il quadro clinico della malattia come ad esempio polimorfismi in sistemi antimicrobici indipendenti dall’ossigeno o in altri componenti del sistema immune. Inoltre la sistematica caratterizzazione del difetto genetico e dei polimorfismi in coorti più estese di pazienti potrà aiutare a correlare i dati clinici e funzionali con il tipo di mutazione trovata.