Molecular and biological aspects of primary immunodeficiency

Background: Primary immunodeficiency diseases (PIDs) comprise a genetically heterogeneous group of disorders which affect distinct components of the innate and adaptive immune system. Over 120 distinct genes have been identified, whose abnormalities account for more than 150 different forms of PID. Clinical presentation is highly variable; actually ranging from various patterns of microbial susceptibility to allergy, lymphoproliferation or autoimmune manifestations. The study of patients affected by immunodeficiencies allows to identify new genes involved in the immune response indeed PIDs represent an optimal model to investigate development, function and regulation mechanisms of immune system. Aim of the study: To define a rational approach to recognize immune deficiencies, with specific emphasis on developing clinical evaluations, understanding the genetic and cellular basis of the disease (Study1 and Study 2), and propose a gene therapy approach as a definitive cure of immunodeficiency due to a defined genic defect (Study3). study1: We report a patient with dysgammaglobulinemia, and gradual decrease of peripheral B lymphocytes. A new Btk mutation was identified in this patient and protein expression was determined. Although clinical and laboratory history is not totally inconsistent with an atypical variant of XLA, it is unclear if all the clinical presentation/picture is influenced by the new mutation. Study2: We report for the first time a case of a female patient with combined immunodeficiency characterised by a complete absence of B cells and NK cells, and their progenitors. Surprisingly, she had an absence of monocytes (CD14+) and DC cells. Direct sequencing of genomic and cDNA of Flt3L, Flt3R, and of major genes (Ikaros and of PU.1) regulating the FLT3-FLT3L expression did not show the presence of any mutations. Levels of Flt3R and Flt3L mRNA in peripheral blood resulted significantly higher (10- and 30- fold increase respectively) with respect to healthy control donor, supporting the hypothesis of an inherited imbalance in the expression of Flt3 ligand mRNA. This finding, in addition to a normal stromal function highlights the possibility of a more specific therapeutic strategy in this child, such as haematopoietic stem cells transplantation. Study3: Gene therapy could represent a definitive cure for patients for whom conventional HSCT is not available. Several clinical trials on XCGD-gene therapy have been conducted since 1997, but they resulted in low and short-term engraftment of CGD-corrected cells. In this study we develop a new strategy for XCGD gene therapy with stem cells, including Lentiviral Vector (LVV) design and microRNA technology, for a safe and effective treatment of X-CGD.

Le immunodeficienze primitive (PID) costituiscono un gruppo eterogeneo di disordini genetici causati da alterazioni delle varie componenti della risposta immune innata ed adattiva. Più di 120 geni sono stati identificati come responsabili delle oltre 150 differenti forme PID. L’eterogeneità genetica e del fenotipo clinico, quest’ultimo caratterizzato da un’alta suscettibilità alle infezioni spesso associata a manifestazioni allergiche, linfo-proliferative ed autoimmuni, rende le immunodeficienze un ottimo modello per lo studio dei meccanismi che regolano lo sviluppo e la funzione del sistema immunitario. Questo lavoro ha lo scopo di suggerire un approccio allo studio delle PID attraverso un’attenta valutazione clinica, genetica e molecolare (studio1 e studio2) e di proporre la terapia genica come cura risolutiva nel caso di immunodeficienze dovute ad un definito difetto genico (studio 3). Studio1: Lo studio di un paziente con disgammaglobulinemia ed una graduale diminuzione dei linfociti B nel sangue periferico, ha rivelato la presenza di una nuova mutazione nel gene Btk che non compromette l’espressione della proteina. Sebbene la storia clinica e di laboratorio, non è totalmente inconsistente con una variante atipica di XLA, non siamo ancora in grado di stabilire se il quadro clinico è dipendente da questa nuova mutazione o dalla combinazione di più mutazioni che interessano geni diversi. Studio2: Descriviamo per la prima volta un caso di paziente femmina con immunodeficienza combinata caratterizzata dalla completa assenza delle cellule B, NK e dei loro progenitori ematopoietici. Sorprendentemente la paziente non ha monociti (CD14+) e cellule dendritiche. L’analisi di sequenza dei geni Flt3R e Flt3L e dei geni che principalmente regolano la loro espressione (Ikaros e PU.1), non ha evidenziato alcuna mutazione. I livelli di Flt3R mRNA e Flt3R mRNA nel sangue periferico risultano significativamente più alti (10- e 30- volte aumentati rispettivamente) rispetto al controllo sano, supportando così la nostra ipotesi di uno sbilanciamento dell’espressione dell’mRNA dell’Flt3 ligand. Questi risultati considerati alla luce di uno stroma funzionale nella nostra paziente, potrebbero suggerire il trapianto come strategia terapeutica futura. Studio3: La terapia genica potrebbe rappresentare la cura definitiva di pazienti per i quali non è possibile fare il trapianto di midollo. Sin dal 997, diversi trial clinici per la terapia genica della XCGD sono stati proposti, ma non sono mai risultati efficaci per una cura a lungo termine. In questo studio noi sviluppiamo una nuova strategia per la terapia genica in pazienti XCGD, basata sui vettori lentivirali e la nuova tecnologia dei microRNA per un controllo del transgene ad un livello post-trascrizionale.