Role of type I IFN in the in vitro differentiation of neonatal dendritic cells

In recent years, a number of reports provided evidence on the importance of type I IFNs in the differentiation, survival and function of several cell types including T cells and dendritic cells (DCs) (Brassard, Grace et al. 2002). IFN-/ has been shown to promote the rapid differentiation of GM-CSF-treated human peripheral blood monocytes into DCs with potent T cell and B cell stimulatory activities (Santini, Lapenta et al. 2000; Honda, Sakaguchi et al. 2003). These results have led to the suggestion that IFN-I could also play a role in the maturation/differentiation of neonatal DCs and in the modulation of Th-1 response which is impaired in neonates. Aim. In this study we focused on DC from umbilical cord blood, as these are the coordinators of the innate as well as the specific immune response, and on the role of type I IFN in their in vitro differentiation/maturation starting from neonatal monocytes. In particular cord blood-derived monocytic cells were cultured in vitro in the presence of GM-CSF and IL-4 or, alternatively, GM-CSF and IFN-α. DCs obtained by the two different methods were analysed in terms of phenotype and functional activity. Wherever possible results from neonatal cord blood-derived DCs were compared with adult peripheral blood-derived DCs. In the mouse model, namely C57BL6 mice, we studied the role of IFN α – in the in vitro differentiation and maturation of bone marrow DC precursors from neonatal mice. Results. Cord blood DCs differentiated in vitro in the presence of IFN were found to have an immature phenotype as they express low levels of costimulatory molecules such as CD80 and CD86. Similar observations were made when neonatal monocytes were cultured in the presence of GM-CSF and IL4 as they displayed reduced HLADR, CD80 and CD40 expression compared to the adult counterparts. Of note, IFN induced differentiation in neonatal cells was still superior to IL4 induced differentiation. No significant differences between cord blood and peripheral blood monocytes were found in the IFN receptor expression during their in vitro differentiation into DCs. The analysis of STAT1, which is the most proximal target of the IFN receptor-associated tyrosine kinases, revealed that a marked tyrosine phosphorylation of STAT1 was observed both in neonatal and adult monocytes at a comparable level ranging from 75% to 90%. DCs in their immature form recognise conserved molecular motifs found in microrganisms by means of pattern-recognition receptors called toll-like receptors (TLRs). The expression pattern of TLRs in IFN-DCs and IL4-DCs have been compared. All monocytes from both peripheral blood (PB) and cord blood (CB) samples expressed TLR-2 and TLR-4 but not TLR-3. Despite the comparable frequencies of monocytes expressing TLR-4, those from cord blood expressed lower amounts of TLR-4 than those from peripheral blood (p < 0.05). From a functional point of view cord blood untreated monocytes and IFN treated DCs showed a deficiency in their ability to respond to LPS and T cell proliferation responses induced by this cells were lower with respect to the peripheral blood counterparts. .Moreover while the majority of PBDCs , either differentiated by IL4 or by IFN, retained comparable phagocytic and processing activity, cord blood IFN-DCs showed a less efficient antigen uptake with respect to the CB IL4-DCs in terms of mannose receptor-mediated endocytosis. Mouse bone marrow derived DCs precursors were coltured in vitro with IFNα alone or in combination with the HBHA (heparin binding haemoagglutinin, a mycobacterial adhesin) antigen and LPS. IFNα treatment proved to be similar to HBHA and LPS stimulation in terms of CD40, CD86 and Class II expression, only the combination of HBHA plus IFNα enhanced DC maturation expecially for Class I expression. The analysis of percentage of mature cells after the stimulation confirmed that IFN alone was not superior to the other stimuli, but it appeared that neonatal bone marrow DCs treated with IFNα, were more efficient inducers of CD4+ and CD8+ mouse lymphocytes proliferation. Conclusions. It is conceivable that IFN can exert opposite effects depending on the timing and the cells differentiation stage, for example by selectively enhancing functional activity at the stage of maturing DCs but exerting an inhibitory effect on DC functions when given at early stages of differentiation. In particular it has been demonstrated that short term IFN stimulation promotes the proliferation of dormant haematopoietic stem cells in vivo whereas chronic IFN treatment exert inhibitory effects on HSC self renewal. Further studies are needed to understand the differential roles that Type I IFN may play in affecting DC function and shaping the immune response in the neonatal environment.

Negli ultimi anni numerose pubblicazioni hanno evidenziato l’influenza che l’IFN di tipo I esercita sul differenziamento, sulla sopravvivenza e sulla funzionalità delle cellule dendritiche e dei linfociti T; in particolare è stato dimostrato l’IFN/ è in grado di indurre in vitro un rapido differenziamento di monociti da sangue periferico in cellule dendritiche particolarmente efficienti nella stimolazione di linfociti T e B (Santini, Lapenta et al. 2000; Honda, Sakaguchi et al. 2003). In questo lavoro abbiamo studiato il ruolo che L’IFN di tipo I riveste sul differenziamento e sulla funzionalità delle cellule dendritiche neonatali. Monociti da sangue di cordone ombelicale sono stati coltivati in vitro in presenza di GM-CSF ed interleuchina 4 (IL4) oppure GM-CSF ed IFN, le cellule dendritiche così ottenute sono state caratterizzate per fenotipo ed attività funzionale. I risultati sono stati paragonati- laddove possibile- con quelli ottenuti dai monociti di sangue periferico. Lo stesso protocollo di coltura in vitro con IFN è stato applicato ai precursori midollari delle cellule dendritiche isolati da topi C57BL6, sempre allo scopo di valutare l’influenza dell’ IFN di tipo I sul loro differenziamento e/o sulla loro maturazione. L’analisi fenotipica delle cellule dendritiche da cordone differenziate con IFN ha evidenziato un fenotipo tipico di cellule immature che esprimono bassi livelli di molecole costimolatorie come CD80 e CD86. Il differenziamento di monociti neonatali in presenza di IL4 ha evidenziato un maggiore grado di immaturità rispetto alla controparte adulta, soprattutto legato ad una espressione ridotta di CD40,CD80 ed HLA-DR. Questi dati sono in accordo con la letteratura corrente, sebbene sia da evidenziare che nel caso di monociti neonatali l’IFN promuove il differenziamento in dendritiche in misura maggiore rispetto al protocollo classico con IL4.D’altra parte monociti provenienti da periferico differenziati in presenza di IFN mostrano un fenotipo semi maturo caratterizzato da una espressione di CD40, CD80, CD86 ed HLA-DR superiore rispetto ai monociti da periferico differenziati in presenza di IL4. I monociti da sangue di cordone risultano essere meno sensibili all’azione dell’IFN rispetto ai monociti da periferico. L’analisi del livello di espressione delle due catene del recettore per l’IFN, IFNAR1 ed IFNAR2, ha rivelato che esiste una modulazione dell’espressione sulla superficie cellulare durante il differenziamento in vitro. Questa modulazione è del tutto sovrapponibile nei monociti da cordone e in quelli da periferico. Allo stesso modo il raffronto fra la percentuale di STAT1 fosforilata rispetto a STAT1, nei monociti neonatali ed adulti , in seguito a stimolazione con IFN, ha dato risultati simili, che si attestano tra valori del 75% e 90% senza evidenziare alcuna differenza per quanto riguarda l’attivazione delle prime fasi del signalling fra cellule adulte e neonatali. Poiché le cellule dendritiche nella loro forma immatura sono in grado di riconoscere gli antigeni mediante recettori di superficie chiamati toll-like receptors, la presenza di questi recettori è stata studiata nei monociti da cordone e da sangue periferico. I monociti da periferico e da cordone esprimono entrambi i TLR2 e TLR4 ma non il TLR3. Inoltre i monociti da cordone esprimono il TLR4 in misura inferiore. Il TLR2 è il recettore per i peptidoglicani mentre il TLR4 è il recettore per il lipopolisaccaride (LPS), entrambi di origine batterica. Da un punto di vista strettamente funzionale i monociti e le dendritiche da cordone non rispondono alla stimolazione in vitro con LPS, che invece costituisce un potente stimolo maturativo insieme al CD40L per monociti e dendritiche da periferico. La capacità delle dendritiche neonatali differenziate con IFN di indurre la proliferazione di linfociti CD4+ e CD8+ da sangue periferico adulto è inferiore rispetto a quella delle dendritiche da cordone differenziate con il protocollo classico. Al contrario dendritiche ottenute in presenza di IFN a partire da cellule del periferico hanno una maggiore capacita allostimolatoria rispetto a quelle derivate in vitro con IL4. Cellule dendritiche da periferico differenziate con entrambi i protocolli mostrano di possedere le stesse attività di endocitosi e macropinocitosi come dimostrato da analisi mediante citofluorimetria dell’uptake con l’utilizzo di antigeni marcati. Per contro dendritiche da cordone differenziate con IFN risultamo meno efficienti nell’endocitare l’antigene rispetto alle dendritiche da cordone differenziate con IL4. Nel modello murino i precursori midollari delle dendritiche di topo sono stati coltivati in vitro in presenza diGMCSF e poi stimolati con IFN, LPS ed HBHA. Quest’ultimo antigene è una emoagglutinina responsabile della disseminazione extrapolmonare del bacillo della tubercolosi. In questo caso l’IFN non si è dimostrato superiore agli altri stimoli nel promuovere la maturazione dei precursori midollari in dendritiche , ma ha dimostrato di avere un effetto sinergico se somministrato in combinazione con l’HBHA, aumentando sensibilmente l’espressione della classe I sulla superficie cellulare. In compenso, in saggi funzionali, le cellule dendritiche stimolate con IFN sono state i più efficaci induttori di proliferazione di splenociti di topo CD4+ e CD8+. E’ stato recentemente dimostrato che un trattamento acuto con l’IFN di classe I è capace di promuovere la proliferazione in vivo di progenitori ematopoietici staminali , mentre la somministrazione continuativa di IFN inibisce i processi di rigenerazione del pool dei progenitori stessi. Si può dunque ipotizzare che l’IFN possa sortire effetti diversi sulle cellule target in funzione del dosaggio e del tipo di somministrazione che viene utilizzato. Pertanto ulteriori studi sono necessari al fine di determinare in modo più dettagliato e conclusivo quale sia l’effetto di questa citochina nel delicato equilibrio che regola la risposta immune nei neonati.