Studio delle basi genetiche e molecolari nella trasmissione interspecifica delle malattie da prioni

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases, are a group of fatal neurodegenerative diseases of humans and animals. They include bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle and scrapie in sheep and goat. The most known human TSEs are Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and variant CJD (vCJD), that is linked to the BSE epidemic. TSEs are characterized by very long incubation periods and invariably fatal outcome. Neurodegenerative changes confined to the central nervous system (CNS) and consisting of neuronal loss, vacuolation of neurons and neuropil, and hyperplasia and hypertrophy of glial cells are the pathological characteristics of these diseases.The conformational modification of the cellular prion protein, named PrPC, into an abnormal protease-resistant isoform, named PrPSc is the key event in TSEs pathogenesis. PrPSc is insoluble, partially resistant to protease and it tends to aggregate into amiloyd fibrils in the CNS of affected subjects. Although they have the characteristic of the neurodegenerative diseases, TSEs show the surprising property of being transmissible. Main objective of the present thesis was to study the mechanisms of interspecies transmission of prion diseases in bank vole or Myodes glareolus, a new animal model highly susceptible to a variety of TSE strains from animals and humans. The study had three different specific aims: 1) investigate whether the susceptibility of vole is imputable to its PrP sequence 2) if so, to identify amino acids residues of PrP which are potentially critical in influencing this susceptibility, 3) whether the susceptibility related to a given PrP sequence is applies to all prion diseases or it is strain-dependent. In order to study the role of bank vole PrP amino acids sequence independently from other cellular factors, the transmission studies were conducted into transgenic mice expressing the PrP of bank vole in a PrP knock-out background. The survival times observed in transgenic animals were compared with those obtained from control groups of voles and wild-type mice. The results showed that transgenic mice have a similar susceptibility to voles and clearly different from wild-type mice, suggesting that the PrP sequence is the principal determinant of susceptibility of voles. This confirmed the minor or absent role of factors different from PrP. Subsequently, with the aim to verify the role of specific amino acid variations on the PrP sequence in modulating the susceptibility of voles, we inoculated a panel of six rodent species showing various degrees of phylogenetic affinity and specific PrP sequence variations, with different TSEs. The results of this studies suggested that specific substitutions modulate the susceptibility of rodents to prion disease, also influencing the dimension of the barrier in interspecies transmission. In comparison to mice, the susceptibility of voles is influenced by the Y154N and S169N variations on the PrP sequence.. Finally, overall results of transmission studies showed that a particular PrP sequence may confer high or reduced susceptibility depending on the prion strains involved. Some strains are transmitted more efficiently to the species with determinate PrP sequence of rather than another, but the opposite may happen using other strains. . In particular, we showed that the Y154N–S169N exchanges, which appeared to confer in vole species a high susceptibility to a given strain, had the opposite effect with another one. These results improve the understanding of the molecular mechanisms underlying the transmission of prion diseases. Here we demonstrate that the transmission barrier is a phenomenon involving two component closely linked each other: the PrP sequence of the infected species (and, in particular, some amino acids residues) and the prion strain. Due to its high susceptibility, the bank vole (Myodes glareolus) is a model of great interest for studing the molecular basis of interspecies transmission of TSEs and helpful for assessing the risk of transmission of prions from one species to another

Le encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST), o malattie da prioni, sono malattie neurodegenerative che colpiscono l'uomo e gli animali. Le più note tra le EST animali sono l’encefalopatia spongiforme bovina (BSE) e la scrapie della pecora e della capra; le forme umane le più note sono la malattia di Creutzfeldt-Jakob (MCJ) e la variante della MCJ (vMCJ), legata all'epidemia di BSE. Le EST sono caratterizzate da tempi di incubazione estremamente lunghi ed esito invariabilmente fatale. Da un punto di vista patologico le lesioni, confinate al sistema nervoso centrale (SNC), consistono in spongiosi del neuropilo, vacuolizzazione e perdita neuronale, iperplasia ed ipertrofia delle cellule gliali. Il momento patogenetico centrale comune a tutte le EST è rappresentato dalla modificazione conformazionale di una proteina cellulare denominata PrPC (proteina prionica cellulare) in una isoforma patologica denominata PrPSc. La PrPSc, insolubile e caratterizzata da una parziale resistenza alle proteasi, si forma in seguito ad alterazioni post-translazionali dell’isoforma cellulare e tende a depositarsi sotto forma di fibrille amiloidee nel SNC dei soggetti colpiti. Nonostante possiedano i caratteri delle malattie neurodegenerative, le EST mostrano la sorprendente proprietà di essere trasmissibili. Obiettivo di questa tesi è stato quello di indagare i meccanismi che governano la trasmissione interspecifica delle malattie da prioni mediante l’utilizzo dell’arvicola rossastra o Myodes glareolus, un nuovo modello animale altamente suscettibile a diversi ceppi di EST. In particolare, la ricerca si è posta l’obiettivo di indagare: 1) se tale suscettibilità fosse da attribuire alla sequenza della PrP dell’arvicola; 2) qualora così fosse, a quali specifici aminoacidi; 3) se tale suscettibilità si esprimesse nei confronti di tutte le malattie da prioni o fosse ceppo-dipendente. Al fine di studiare il ruolo della PrP dell’arvicola in modo indipendente rispetto ad altri possibili fattori cellulari, sono stati condotti studi di trasmissione di diversi ceppi di prione in topi transgenici esprimenti la PrP di arvicola su un background knock out. I tempi di sopravvivenza sono stati analizzati per definire le caratteristiche di trasmissione nel modello transgenico e i risultati messi a confronto con quelli ottenuti inoculando gruppi di controllo di topi wild-type e di arvicola rossastra. Lo studio ha dimostrato che i topi transgenici acquisiscono caratteristiche di suscettibilità simili a quelle dell’arvicola, suggerendo che è la sequenza della PrP il maggiore determinante di suscettibilità dell’arvicola e confermando l’assenza o l’azione minoritaria di fattori specie-specifici diversi dalla PrP. Successivamente, al fine di verificare l’eventuale ruolo prevalente di specifici residui aminoacidici della PrP nel modulare la suscettibilità, sono state inoculate, con differenti ceppi di prione, sei diverse specie di roditori che mostrano diversi gradi di affinità filogenetica e specifici polimorfismi nella sequenza della PrP. L’analisi dei risultati suggerisce che alcuni siti polimorfici della PrP sono in grado di modulare la suscettibilità delle diverse specie ai prioni, facilitando o ostacolando la trasmissione e condizionando - nella trasmissione interspecifica - l’ampiezza della barriera di trasmissione. In particolare, le posizioni Y154N e S169N sembrano essere i principali determinanti della peculiare suscettibilità dell’arvicola e di altri roditori che condividono con essa le stesse caratteristiche nella sequenza della PrP. Infine, i dati di trasmissione hanno indicato come una determinata sequenza della PrP non conferisce elevata o ridotta suscettibilità in termini generali. Alcuni ceppi infatti mostrano di essere trasmissibili in maniera più efficiente alla specie portatrice di una determinata sequenza della PrP piuttosto che ad un’altra, ma il contrario può accadere impiegando altri ceppi. I risultati di questo studio hanno importanti implicazioni nella comprensione dei meccanismi molecolari alla base della trasmissione delle malattie da prioni e dimostrano che la barriera di trasmissione è un fenomeno cui partecipano due componenti intimamente correlate tra loro: la sequenza della PrP della specie infettata (e, in particolare, alcune posizioni “critiche”) ed il ceppo di agente. Grazie alla elevata suscettibilità, l’arvicola rossastra (Myodes glareolus) si dimostra un modello di grande interesse per lo studio delle basi molecolari della trasmissione interspecifica delle EST e per “modellare” il rischio di trasmissione dei prioni da una specie animale ad un’altra