Caratterizzazione molecolare e funzionale di nuove mutazioni nelle encefalomiopatie mitocondriali

Mitocondrial ATP synthase consists of two functional domains, F1 and F0. F1 protudes in to the matrix, is hydrophilic, and contains five subunits (3α,3β,γ,δ,ε) and inibibitor protein. F0 is hydrophobic, is embedded in the mitochondrial inner membrane, and contains subunits a, b, c, d, e, f, g, F6, OSCP and A6L. F1 is connected to F0 by a stalk that contains the subunits OSCP, F6, b, d. Subunits 6 and A6L are encoded by the mitochondrial genome whereas all of the other subunits are encoded by nuclear genes. ATP synthase deficiency can therefore be due to mutations of either nuclear or mitochondrial genes. Mutations in the ATPase 6 gene, characterized by a profound defect of the activity of the enzyme, are recognized as a cause of maternally-inherited LS. Leighâ s syndrome (LS) is a neurodegenerative disorder of infancy characterized by developmental delay, psychomotor regression, seizures, and symptons of brainstem dysfunction. In addition, biochemical defects in complex I, complex IV and PDHC underlie most of the LS patients. In order to know the different pathogenic mechanism leading to diverse clinical severity, of the mutations in the ATPase 6 gene, we compared cellular ATP production, cell growth and entity of cellular response upon use of metabolic stressors in primary cell cultures obtained from patients harboring either the T8993G, or T8993C, or T9176G, or T9176C and in cybrids clones obtained after fusion of each primary cell lines with Ï 0 cells. Arginine (â â Râ â ) mutations were associated with a much more severe phenotype than Proline ( P ) mutations, in terms of both biochemical activity and growth capacity. Also, a threshold effect in both R mutations appeared at 50% mutation load. Different mechanisms seemed to emerge for the two R mutations: the F1 seemed loosely bound to the membrane in the L156R mutant, whereas the L217R mutant induced low activity of complex V, possibly the result of a reduced rate of proton flow through the A6 channel.

Le encefalomiopatie mitocondriali rappresentano un gruppo di malattie estremamente eterogeneo ed in continua crescita sia per il sempre maggiore numero di fenotipi clinici descritti che per le conoscenze delle basi molecolari che le sottendono. Esse sono, collettivamente, il risultato di una diminuita capacità da parte dei mitocondri di soddisfare le richieste energetiche della cellula, a causa per lo più della ridotta attività enzimatica della catena respiratoria e la conseguente compromessa produzione di ATP intracellulare. In questo studio sono state indagate le conseguenze patogenetiche delle quattro mutazioni più frequentemente associate alla NARP/MILS - T8993G (L156R), T9176G (L217R), T8993C (L156P) e T9176C (L217P) - nel gene mitocondriale ATPasi 6, che codifica per una subunità del complesso V. La F1F0-ATP sintetasi (complesso V) è un enzima ubiquitario, presente nelle membrane dei batteri, dei cloroplasti e nella membrana interna dei mitocondri dove sintetizza ATP, l' ultimo step della fosforilazione ossidativa (Garcia, 2002). L' enzima è costituito da due subcomplessi F0 e F1. L' attività catalitica dell' enzima è localizzata nella porzione F1, che è estrinseca alla membrana ed utilizza il gradiente protonico per convertire ADP in ATP e viceversa; la subunità F0 si trova nella membrana mitocondriale interna e permette il flusso di protoni dallo spazio intermembrana alla matrice. Valutando la capacità duplicativa delle cellule in terreno standard, abbiamo potuto osservare che i fibroblasti di pazienti con la mutazione T->G, crescono con maggiore difficoltà rispetto a quelli con la mutazione T->C ed ai fibroblasti di controllo. Questa condizione si aggrava ulteriormente quando le cellule vengono sottoposte a stress, come la sostituzione del glucosio con il galattosio, un metabolita che entrando nella glicolisi più a valle, fornisce un numero minore di molecole di ATP e mette in evidenza i danni a carico della catena respiratoria. L' attività del complesso V, in termini di sintesi ed idrolisi, della catena respiratoria è stata valutata sui mitocondri ottenuti sia dai fibroblasti omoplasmici per le quattro mutazioni, che da cloni a diversa percentuale di mutazione. Tali indagini, effettuate mediante metodiche di tipo spettrofotometrico, hanno confermato la gravità delle mutazioni T->G rispetto alle varianti alleliche in entrambi i tipi cellulari. Lâ utilizzo inoltre di cloni a diversa percentuale di mutazione, ha consentito di determinare la soglia del fenotipo patologico per le mutazioni T->G. Inoltre abbiamo studiato lâ effetto dell' oligomicina e della sonicazione sull' attività dell' ATPasi nelle cellule primarie e nei cloni. I nostri risultati suggeriscono che le linee primarie con la mutazione L156R esibiscono una porzione F1 debolmente legata alla membrana poiché l' attività idrolitica non è pienamente sensibile alla oligomicina e poiché a 20â di sonicazione l' ATPasi diventa insensibile all'inibitore, probabilmente per il dovuto rilascio della porzione F1 dalla membrana.